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1、联合检测大肠癌组织中PTEN与CyclinD1的表达及DNA含量的临床意义【摘要】 目的：探讨大肠癌组织中PTEN和CyclinD1的表达及与DNA含量联合检测的关系及意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测58例大肠癌及14例癌旁正常大肠黏膜组织中PTEN和CyclinD1蛋白表达;应用流式细胞术检测以上组织中PTEN和CyclinD1的DNA含量;分析它们之间及与肿瘤分期、分级的关系。结果：PTEN蛋白在大肠癌组织中的表达(65.52%)显著低于癌旁正常组织(100%),CyclinD1蛋白在大肠癌组织中的表达(60.34%)显著高于癌旁正常组织(1.72%),两种蛋白在大肠癌组织中的表达呈
2、负相关(r =-0.71);大肠癌组织的异倍体率(68.97%)显著高于癌旁正常组织(0);PTEN阳性组的DNA指数(DNA index，DI)、S期细胞比率(S-phase fraction ，SPF)均低于阴性组(P<0.05)，CyclinD1阳性组的DI及SPF均高于阴性组(P<0.05);两者的表达与肿瘤病理分级、Dukes分期及淋巴结转移相关;淋巴结转移患者的异倍体率及SPF均高于无淋巴转移患者(P<0.05)。结论：PTEN和CyclinD1基因的异常改变可能参与大肠黏膜细胞的恶性转化过程，两者的变化存在相关性;DNA含量的变化可能与淋巴结转移有关。联合检测P
3、TEN、CyclinD1蛋白及DNA含量可作为评估大肠癌病理生物学行为和预后的重要指标。 【关键词】 大肠肿瘤癌基因DNA，肿瘤【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression of PTEN、CyclinD1 and DNA content in the tissue of colorectal carcinomas, and to discuss their relationships. Methods: The expression of PTEN and CyclinD1 in 58 cases of human colorecta
4、l carcinomas and 14 case of tumor-side normal tissue were detected by immunohistochemical technique; DNA content was measured by flow cytometry. Results: The positive expressive rate of PTEN in the colorectal carcinoma was 65.52%，which was lower than 93.10% of the tumor-side normal tissue, (P<0.0
5、1). The positive expressive rate of CyclinD1 in the colorectal carcinoma was 60.34%,which was higher than 1.72% of the normal tissue. The expression of PTEN and CyclinD1 showed a negative correlation with each other (r =-0.71). The DNA index (DI) and sphase fraction (SPF) in the positive group of PT
6、EN were lower than those in the negative group，and the DI in the positive group of CyclinD1 was higher than this in the negative group (P<0.05). The expression of PTEN and CyclinD1 in colorectal carcinoma were associated with degree of differentiation of carcinoma, Dukes stage and lymph node meta
7、stasis of the tumors;the aneuploid ratio and SPF in lymph node metastasis positive patients were higher than those in the negative patients (P<0.05). Conclusion: The abnormal expression of PTEN and CyclinD1 participate the malignant conversion process of the colorectal mucosa cell;DNA content is
8、related to lymph node metastasis;the expression levels of PTEN、CyclinD1 and the DNA content may be the important indicator to evaluate the pathologic biology behavior and the prognosis of the colorectal carcinoma.【KEY WORDS】 Colorectal carcinomaOncogenesDNA,neoplam大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病机制一直是基础和临床研究的热点
9、。目前的研究发现，细胞周期调控的紊乱、抑癌基因的失活与大肠癌的发生、发展关系密切。PTEN是一种具有磷酸酶活性的多功能蛋白，通过作用于PI3K/AKT、FAK/P130、ERK/MAPK等途径抑制细胞周期和促进细胞凋亡 1;CyclinD1是G1期中含量最高、活性最强的细胞周期素，其过度表达可以导致细胞周期异常2。PTEN对细胞周期的调节需要与CyclinD1发生作用3。本研究通过检测大肠癌及癌旁正常组织中两种蛋白的表达及细胞DNA的含量，探讨它们相互之间及与肿瘤分级、临床分期的关系，以帮助临床诊断治疗和判断预后。1资料与方法1.1一般资料选择2006年10月2007年9月于我院手术切除、经临
10、床和病理组织学确诊的58例大肠癌组织及癌旁正常黏膜组织(距肿瘤边缘>2 cm)的石蜡标本。所有患者术前均未接受化学治疗、放射治疗和免疫治疗。其中男35例，女23例;年龄3179岁，平均57.9岁;高分化腺癌15例，中分化腺癌23例，低分化腺癌20例。临床Dukes分期：A期14例，B期25例，C期15例，D期4例。1.2主要试剂与仪器鼠抗人PTEN和兔抗人P27单克隆抗体工作液、SP-9000 HistostainTM-Plus Kits免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。RM2135切片机(LEICA Germany);OLYMPUS CX71三色
11、荧光显微镜及照相系统(日本);美国Beckman Coulter流式细胞仪(Epics XL型)。1.3检测方法及判定标准1.3.1免疫组织化学染色采用SP法免疫组织化学染色，用已知PTEN染色阳性的前列腺组织切片及P27阳性的胃癌组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗做阴性对照。PTEN蛋白阳性表达在细胞质;P27蛋白阳性表达主要在细胞核，但也有部分在细胞质，两者均为棕黄色颗粒。每张病理切片随机选取10个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，共1 000个，计算PTEN蛋白和p27蛋白阳性细胞所占比例，10%为(-)，>10%为 (+)。1.3.2流式细胞检测50 m厚度切取所有组织蜡块
12、各4张，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS漂洗后置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.0)中加热至90，保温1 h;冷却至室温后弃柠檬酸，加入0.1%胶原酶及0.1%中性蛋白酶的混合溶液，37孵育1 h，以单纯RPMI 1640培养液终止酶作用;加适量PBS液，800 r/min离心5 min，弃上清;加PBS制成单细胞悬液，经400目滤网过滤，调整细胞浓度为106 mL-1;0.1%Rnase37作用1 h，离心后加0.02%PI，暗处放置30 min后上机。DNA倍体测定：流式细胞仪线性采集约10 000个细胞，Multi Cycle软件分析结果。以DNA指数(DNA index
13、, DI)表示DNA的相对含量;以正常人淋巴细胞DNA含量G0/G1峰均道值为二倍体细胞的标准。DI=样本G0-G1峰均道值/正常对照G0-G1峰均道值，变异系数(CV)8%。1.0-2CVDI1.0+2CV时，确定样本为二倍体;DI>1.0+2CV时，为异倍体。异倍体率=异倍体样本数/ (二倍体样本数+异倍体样本数) 100%;同时计算S期细胞比值(S-phase fraction, SPF)=S/(G0-G1+S+G2-M)100%。1.4统计学处理应用SPSS13.0统计软件，蛋白阳性率比较及相互关系分析用2检验及spearman等级相关分析;DI及SPF均值比较用t检验。P0.0
14、5为差异有统计学意义。2结果2.1PTEN、CyclinD1的表达及DNA含量分布PTEN蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率(65.52%)显著低于癌旁正常组织(100%，P<0.01，表1，图1);CyclinD1蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率(60.34%)显著高于癌旁正常组织(3.45%，P<0.01，见表1，图2)。大肠癌组织的DNA异倍体率、SPF均高于癌旁正常组织 (P<0.05，图34，见表1)。2.2PTEN、CyclinD1的表达与DNA含量的关系PTEN表达阳性组的DI及SPF均低于阴性表达组，(P<0.05);CyclinD1表达阳性组的DI及SPF均
15、高于阴性表达组(P<0.05，表2)。2.3PTEN及CyclinD1在大肠癌中表达的相关性对58例大肠癌组织中PTEN及CyclinD1的表达进行相关分析，结果显示：r=-0.7135，P<0.01，说明PTEN在大肠癌组织中的表达与CyclinD1呈负相关。2.4PTEN、CyclinD1的表达及DNA含量与临床病理特征的关系PTEN及CyclinD1的表达在不同性别、年龄及肿瘤的部位、大小、浸润深度的大肠癌患者间差异均无统计学意义(P>0.05);但在不同肿瘤病理分级、Dukes分期及有无淋巴结转移患者间存在统计学差异(P<0.05);DNA异倍体率、SPF与患者
16、的性别、病理分级和临床分期等无明显关系(P>0.05);但与淋巴转移有关(P<0.05，表3)。3讨论3.1PTEN和CyclinD1在大肠癌组织中的表达及意义PTEN作为重要的抑癌基因，其缺失或(和)突变与子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌及胃癌等多种肿瘤的发生发展有关1。Zhou等4研究发现PTEN基因突变是大肠癌发生发展中的早期事件。Khaleghpour等5发现在结肠癌细胞中PTEN明显缺失。本研究发现大肠癌肿瘤分化程度越低、Dukes分期越晚和出现淋巴结转移时，PTEN表达缺失越明显，提示PTEN在大肠癌的发生和发展中发挥重要作用。CyclinD1是细胞周期素家族最重要的成员之一，为目前公认的癌基因。正常人体组织
