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1、差异性应激对青、老年大鼠海马HSP70 mRNA表达的影响【摘要】 目的 观察重复低强度强迫游泳应激后青、老年大鼠海马HSP70 mRNA表达及习惯化表达；增强应激强度对青、老年大鼠海马HSP70 mRNA表达的影响。方法 采用反转录聚合酶链反应（RTPCR）方法，观察重复强迫温水游泳应激导致青年组（2个月龄）、老年组（16个月龄）大鼠海马HSP70 mRNA表达的变化和增强应激强度对HSP70 mRNA表达的影响 。结果 重复强迫温水游泳可导致两组大鼠HSP70 mRNA表达习惯化，当再给予4冰水游泳应激时，可引起HSP70 mRNA表达增加；老年组大鼠HSP70 mRNA表达在多时段均低于
2、青年组大鼠(P0.05)。结论 重复应激可以导致HSP70 mRNA表达习惯化，高强度应激可以逆转低强度应激引起的习惯化效应；老年组大鼠应激后HSP70 mRNA表达在多时段低于青年组大鼠。 【关键词】 应激；强迫游泳；热休克蛋白70 mRNA；海马应激引起多种组织器官的热休克蛋白(HSP)家族表达水平增加，且表达程度与应激强度和时程有关1，其中HSP70是表达范围最广泛、表达量最多的一组。应激源类型、机体衰老程度与性别等与HSP70表达有密切关系。随着年龄的增加，细胞合成HSP70的能力降低2。但目前改变应激强度和时程条件对不同衰老大鼠HSP70表达的影响尚未见报道。本文旨在检测差异性应激对
3、不同月龄大鼠海马HSP70 mRNA表达的影响。1 材料与方法1.1 动物青年组2月龄雄性Wistar大鼠35只，体重180220 g；老年组16月龄35只，体重450500 g，山东大学动物实验中心提供。老年组分为A、B、C三组，青年组分为a、b、c三组，每笼5只喂养，自由饮食，在光暗周期为12 h（光照时间6：0018：00）、稳定室温（202）、隔音条件下适应性饲养1 w。1.2 应激处理A与a组：低强度重复应激组（慢性应激习惯化组）：第182天，每天上午8：00开始，将实验动物逐一放入水深25 cm，水温25的玻璃水缸（长宽高70 cm40 cm80 cm）中强迫游泳8 min，1次/
4、d，共8次。B与b组：低强度重复应激强应激组(去习惯化组)：第17天，每天上午8：00开始，将实验动物逐一放入水深25 cm，水温25的玻璃水缸中强迫游泳8 min，每天1次，共7次；第8天上午8：00开始，将实验动物逐一放入盛有4冰水混合物的玻璃缸中强迫游泳8 min。C与c组：对照组，相同饲养条件下。每次强迫游泳结束后，都将动物放回原笼中，自由饮食、进水，直至下次期间保持大鼠尽可能不受外界刺激。1.3 组织取材与组织总RNA提取（Trizol一步提取法）每组大鼠于急性刺激后第0、30、60、180、30 min各随机选取3只，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）经腹腔麻醉后，由大鼠颈后开颅
5、取脑，分离海马组织，迅速放入-80冰箱冻存。称取约100 mg的组织放入研磨器中加入1 ml Trizol，反复研磨后放置5 min，加入氯仿剧烈振摇，离心后转移上清至Eppendonf管中加入异丙醇放置10 min，8 000 r/min离心10 min，弃上清，用75%乙醇洗沉淀，混匀后离心倒掉乙醇，空气中干燥，用DEPC水溶解RNA，-80冰箱中保存。1.4 RTPCR法检测HSP70 mRNA表达HSP70（350 bp）引物前向:5CGCGACCTGAACAAGAGCAT3，反向：5TCGAAGGTCACCTCGATCTG3；actin（500 bp）引物前向：5GTGGGGCGCC
6、CCAGGCACCA3,反向：5CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3；94预变性3 min后，94 30 s，55 1 min，72 1 min，扩增28个循环，72延伸10 min后终止反应，扩增产物4冰箱保存待分析。取HSP70 mRNA扩增产物5 l和actin PCR扩增产物2 l加入同一点样孔进行1.7%的琼脂糖凝胶电泳，电压80 V，时间45 min，然后用SmartView凝胶扫描分析仪扫描，以HSP70 mRNA带峰面积与内参照actin带峰面积比值表示HSP70 mRNA相对表达量，并记录数据。1.5 统计学处理应用SPSS11.0统计软件进行分析，数据以xs表示
7、，组间比较用t检验。2 结 果2.1 慢性应激对不同大鼠海马HSP70 mRNA表达的影响老年A组与青年a组大鼠接受连续8 d强迫25温水游泳后，海马HSP70 mRNA表达立即增加，其中老年A组大鼠HSP70 mRNA表达量在应激后的0、30、60、180、360 min各时点均高于老年C组(0.0610.005)，且在0、30、60、180 min 4个时点差异显著（P0.001，P0.001，P0.05，P0.001）；慢性应激青年组大鼠海马HSP70 mRNA相对表达量在应激后的0、30、60、180、360 min各个时点分别均高于青年c组(0.4880.023)，但仅在60和180
8、 min时点差异显著（均P0.001）。青年a组大鼠海马HSP70 mRNA相对表达量在应激后0、30、60、180、360 min各个时点的相对表达量分别为0.5280.075、0.4900.012、0.7770.012、0.7490.008、0.5410.064；老年A组则分别为0.1430.004、0.2770.07、0.1200.012、0.1220.007、0.0880.016，均低于青年a组大鼠，且在30、60、180、360 min时差异显著（均P0.001）。2.2 差异性应激对不同月龄大鼠海马HSP70 mRNA表达的影响老年B组大鼠在应激后0、30、60、180、360 m
9、in各时点海马HSP70 mRNA相对表达量分别为0.5280.003、0.5460.014、0.5940.008、0.7260.007、0.6090.051，均高于老年A组，且差异显著（均P0.001）；青年b组大鼠在应激后0、30、60、180、360 min各时点海马HSP70 mRNA的相对表达量分别为0.6850.015、0.7600.003、0.8060.011、0.7370.008、0.7540.024，均显著高于青年a组，且在时点0、30、60、360 min差异显著（P0.05，P0.001，P0.05，P0.05）。同时，老年B组大鼠海马 HSP70mRNA相对表达量在增强
10、应激强度后的各时点均低于青年b组大鼠，但差异不显著。3 讨 论 海马与学习、记忆及情感反应密切相关，是介导应激反应的主要脑区。它的损伤与复发性抑郁症、创伤后应激障碍及Alzhimer病和癫痫的发病有密切关系35。本研究结果显示，慢性应激青年组和老年组大鼠在应激后海马HSP70 mRNA的相对表达量升高，在3 h后逐渐降低，到6 h接近基础水平，说明在慢性应激作用下，机体对应激源具有一定的适应反应，在新的水平上形成一种平衡状态，HSP70mRNA的转录也维持在较低水平，达到了新的生理稳态，出现习惯性反应。 去习惯化青年b组和慢性应激青年大鼠接受相同强度和性质的应激源作用后，重复低强度应激青年组大
11、鼠HSP70 mRNA表达出现习惯化，b组大鼠则在最后1 d接受同性质的强刺激，则其海马HSP70 mRNA相对表达量在应激后的各个时点均明显增加，与慢性应激组动物表达量之间差异有显著性（P0.05），且随时间延长而表达增加，在达高峰后稍有降低，但均高于慢性应激组各时点HSP70 mRNA的相对表达量，表明应激习惯化后应激强度增加，能够逆转慢性应激引起的应激习惯化效应，引起更强烈的应激性反应。结果同时显示出青年组大鼠海马 HSP70 mRNA相对表达量在增强应激强度后的各时点均高于老年组大鼠，但差异无显著性。 应激因素可以诱导HSP70表达，这种表达虽然高度保守，但有实验表明，很多因素都会对H
12、SP70的表达水平产生影响，其中衰老因素是重要的影响因素之一。随着年龄的增加，HSP70表达水平降低，提示机体应激耐受能力逐渐降低。动物实验表明，机体衰老时HSP70的表达水平和诱导性明显降低5。衰老是生物体的一个必然结局，衰老机体对各种外界应激因素如高温、体力锻炼、感染、手术等反应能力或耐受力降低。本次实验提示随年龄增加，机体应激反应能力和应激保护因子降低。【参考文献】 1 Lawrence DA，Kim D.Central/peripheral nervous system and immune responsesJ.Toxicology，2000；142(3):189201.2 Njem
13、ini R，Abeele MV，Demanet C,et al.Agerelated decrease in the inducibility of heatshock protein 70 in human peripheral blood mononuclear cellsJ.Clin Immunol，2002；22（4）:195205.3 Bliss TV，Collingride GL.A synaptic model of memory:long term potentiation in the hippocampusJ.Nature，1993；361（6407）:319.4 Bremner JD.Does stress damage the brainJ?Biol Psychiatry，1999；45（7）:797805.5 Heydari AR，You S.Takahashi R,et al.Agerelated alteration in the activation of heat shock transcription factor 1 in rat hepatocytesJ.Exp Cell Res,2000；256（4）:8393.
