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1、RT-PCR方法检测细胞信号传导抑制因子-1（SOCS-1） mRNA在髓性白血病中的表达 作者：杨海平，戴敏，周红升，黄亮，张东华【摘要】 为了研究细胞信号传导抑制因子（SOCS-1）在急性和慢性髓性白血病患者外周血中的表达并探讨其临床意义，用RT-PCR的方法检测急性和慢性白血病患者外周血单个核细胞中SOCS-1 mRNA的表达，并将其表达与所有患者的病情进行了分析。结果显示： 在25例急性髓性白血病患者中4例 SOCS-1 mRNA表达阳性，阳性率1600%，在25例慢性髓性白血病患者中11例SOCS-1 mRNA表达阳性，阳性率44.00 %，二者差异有统计学意义。在25例慢性髓性白血
2、病患者中，无进展组（慢性期）12例，阳性2例，而进展组（加速期和急变期）13例，阳性11例，两组间差异有统计学意义。SOCS-1 mRNA阳性的CML患者，对干扰素治疗反应差，进入加速期后SOCS-1 mRNA多数呈持续阳性表达，病情进行性发展，预后极差。结论：急性和慢性髓性白血病患者外周血单个核细胞中均可检测到SOCS-1 mRNA的表达，CML患者阳性率高，加速期与急变期表达阳性者显著增多，与干扰素治疗反应及预后密切相关。 【关键词】 RT-PCR；SOCS-1 mRNA；白血病Detection of SOCS-1 mRNA Expression by RT-PCR in the Pat
3、ients with Myeloid LeukemiaAbstract In order to investigate the suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS-1) expression in peripheral blood mononuclear cells（PBMNC）of patients with acute and chronic myeloid leukemia and analyze its clinical significance，RT-PCR method was used for detecting SOCS-1 mRN
4、A expression in PBMNC of 50 newly diagnosed patients. The result showed that positive expressions of SOCS-1 were observed in 4 of 25 patients with AML (16.00%)，in 11 of 25 patients with CML (44.00%) and none in 10 normal controls. The differences between patients with AML and normal controls，and bet
5、ween patients with CML and normal controls were statistically significant. In CML group，2 out of 12 cases with non-progression (chronic phase)，9 of 13 cases with progression showed the positive expression，the difference between two subgroups was statistically significant. Those CML patients with SOC
6、S-1 mRNA expression had poor response to IFN-. When they transformed into accelerated phase，SOCS-1 mRNA expression was more persistently and frequently observed，and no response to IFN- was observed. Most of them had very poor prognosis. It is concluded that the SOCS-1 mRNA can be detected in the PBM
7、NC of the patients with acute and chronic myeloid leukemia. The SOCS-1 mRNA expression in the patients with CML is higher than that in patients with AML，and it is higher in accelerated phase and blast crisis significantly. This phenomenon is highly related to the reaction of IFN- and prognosis.Key w
8、ords RT-PCR; SOCS-1 mRNA; leukemia 细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是近几年才发现的一类新型免疫蛋白分子，主要包括8个成员，即SOCS-1SOCS-7和CIS。在SOCS家族中最受关注和研究最多的是SOCS-1。为了研究SOCS-1在急性和慢性髓性白血病患者中的表达，进一步研究SOCS-1与白血病的关系，我们应用RT-PCR的方法检测SOCS-1 mRNA在急性和慢性髓性白血病患者外周血单个核细胞中的表达，初步探讨其临床意义。材料和方法临床资料本研究选择华中科技大学同济医学院同济医院血液科2
9、005年1月至2005年12月间收治的50例白血病患者。急性髓性白血病（AML）25例，其中M1型2例，M2型6例，M3型7例，M4型4例，M5型5例，M6型1例；慢性髓性白血病（CML）25例，其中慢性期12例，加速期6例，急变期7 例。50例病人中男29例，女21例，年龄16-67岁，中位年龄31岁。所有患者均经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学检查确诊，采用MICM分型。以5名正常人和5例良性血液病患者(缺铁性贫血3例，巨幼细胞性贫血2例)作对照，其中男性6例，女性4例，年龄11-56岁，中位年龄26岁。病例分组50例患者根据临床诊断分为2组：急性髓性白血病组和慢性髓性白血病组；
10、慢性髓性白血病再分为无进展组（慢性期）和进展组（加速期、急变期）；分析CML患者临床资料时，根据是否表达SOCS-1 mRNA分为2组，简称为阴性组和阳性组。白血病治疗方案及疗效评价AML 诱导化疗采用标准DA方案(柔红霉素（40-60）mg/d3天、阿糖胞苷100-200 mg/（m2d）7天，对AML-M3患者用维甲酸（ATRA）或三氧化二砷进行诱导治疗；缓解后巩固治疗用HA、DA、MA以及大剂量阿糖胞苷等方案交替化疗，AML-M3患者在维甲酸或三氧化二砷诱导缓解及维持治疗的基础上应用上述化疗方案交替治疗，标准化疗2个疗程以上未达到完全缓解者为难治性白血病病例。CML 慢性期采用羟基脲和（
11、或）阿糖胞苷（50-100）mg/d10-20天联合应用干扰素（300万U-500万U，肌肉注射，隔日1次，疗程半年到1年）治疗，8例患者采用格列卫（600 mg/d）治疗。所有患者治疗前行染色体检查，半年后复查骨髓像及染色体，评价治疗效果，Ph染色体阳性率35%-90为轻微细胞遗传学反应，Ph染色体阳性率1%-34为部分细胞遗传学反应，0为完全细胞遗传学反应。加速期和急变期患者根据病情进展的类型采用联合化疗。试剂和仪器所用TRIZOL试剂购自Invirtrogen公司，逆转录试剂盒购自MBI公司，引物设计参照文献1进行。SOCS-1上游引物： 5-CACGCACTTCCGCACATTCC-3
12、，下游引物：5-TCCAGCAGCTCGAAGAGGCA-3，扩增片段大小为280 bp；GAPDH上游引物：5-GCTGGCGCTGAGTACGTCGT-3，下游引物：5-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3，扩增片段大小为604 bp，由上海博亚公司合成。DL2000 Marker购自TaKaRa公司。RT-PCR检测总RNA纯化提取 取外周血3-5 ml，枸橼酸钠抗凝，用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入1ml TRIZOL，按试剂说明书中操作步骤提取RNA。使用分光光度仪检测抽提总RNA的质量和浓度，要求A260/A280的比值在2.0左右，并记录RNA含
13、量。cDNA的合成 反应体系20 l。每1份标本取RNA 2 g，Oligo（dT）1 l，5反应缓冲液4 l，RNA核酸酶抑制剂1 l，10 mmol/L dNTP 2 l，MMLV 1 l，加DEPC处理的双蒸馏水至20 l。25 10分钟，42 60分钟，70 10分钟进行逆转录，合成好的cDNA置于-80保存备用。RT-PCR反应 反应体系： 10buffer 2 l，2dNTP 2 l，Taq酶 0.5 l，MgCl2 1.2 l，双蒸馏水10.3 l，前引物1 l，后引物1 l，配成18 l的反应混合物，再加入模板DNA 2 l，配成20 l的反应体系，在PTC-100 PCR扩增
14、仪上反应。反应条件： 94预变性3分钟，94变性45秒，58退火45秒，72延伸45秒，循环35次，最后72延伸5分钟，终止反应。在GeneGenius成像系统下观察结果。统计学处理使用SAS 9.0软件进行统计分析。结 果25例急性髓性白血病患者中，4例检测出SOCS-1 mRNA（图1），阳性率16.00 %，25例慢性髓性白血病患者中，11例检测出SOCS-1 mRNA，阳性率44.00 %（表1），经卡方检验，2 =4.6667，P=0.031。AML与CML两组表达SOCS-1 mRNA阳性率的差异有统计学意义。 25例CML患者中，无进展组12例，SOCS-1 mRNA阳性2例，进
15、展组13例，阳性9例（加速期4例，急变期5例）（表2），两组之间比较，P=0.015（Fisher确切概率法），差异有统计学意义(图2)。对照组的正常与良性血液病患者中未检测到SOCS-1 mRNA的表达。 分析25例CML患者临床资料，比较SOCS-1 mRNA阴性和阳性两组之间干扰素联合化疗的治疗反应，结果阳性组有效3例，阴性组有效11例（P<0.05，Fisher确切概率法)。疗程结束后评价细胞遗传学反应情况，多数呈现轻微细胞遗传学反应，SOCS-1 mRNA持续阳性表达，预后极差。对于急性白血病，由于阳性例数过少，不能准确分析其与治疗反应的关系。讨论SOCS在细胞因子诱导下产生，反过来抑制细胞因子的信号转导，成为细胞因子信号转导负反馈调控环的一部分2，3。SOCS蛋白在体内可阻断增强的细胞因子效应，它不仅是细胞因子的调节者，而且在控制细胞分化和决定细胞命运方面起重要作用。SOCS-1表达失常在人类疾病，尤其是在恶性肿瘤的发病中有重要作用。 白血病是目前发病率最高的血液系统恶性肿瘤，具有高度异质性，近年来越来越多的研究者开始关注SOCS-1与白血病的关系。本研究进行了SOCS-1与白血病关系的初步研究。结果表明，急性和慢性髓性白血病患者外周血单个核细胞中均可检测到SO
