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1、第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 P G 0 4 7 磺化修饰结合离子交换色谱和生物质谱富集鉴定含组氨酸肽奎 曹冬a ，周春喜a ，张养军8 ，钱小红矿 ( 。军事医学科学院放射与辐射医学研究所一北京蛋白质组研究中心一蛋白质组学国家重点实验室， 北京1 0 2 2 0 6 ) 随着电喷雾电离( E S D 和基质辅助激光解吸电离( M A L D I ) 等软电离质谱技术的进步，生物质谱在蛋 白质组学研究中发挥着越来越重要的作用。但对于复杂的生物样品，现有的质谱仪无法直接对其进 行完全的分析，通常是通过预分离来降低体系的复杂程度，以提高被鉴定蛋白质的数目。而鉴定一 个蛋白质并不
2、需要对其所有肽段进行鉴定，具有高度序列特异性和一定长度的一个肽段往往就可以 作为标签肽，用于其母蛋白质的鉴定。采用标签肽分离技术来减小待分析肽段的数目，通过选择性 分离含低丰度氨基酸残基的标签肽，可以大大降低肽段混合物的复杂程度，提高标签肽的相对丰度 及被鉴定的机会。组氨酸是蛋白质中丰度相对较低的一种氨基酸，组氨酸肽可被用作标签肽“1 。 本研究通过在肽段的N 端引入磺酸基，从而使含组氨酸的肽段与其他肽段在p H 3 0 的条件下产生电 荷差异，建立了一种基于强阳离子交换色谱和质谱富集鉴定组氨酸标签肽段的新方法。该方法不仅 可以有效地富集含组氨酸的肽段并对其进行鉴定，而且通过在肽段的N 端引入
3、磺酸基，可以促进肽 的裂解，使之产生简单而信息丰富的二级质谱图，甚至不需要通过数据库检索既可进行从头测序。 关键词组氨酸标签肽；磺化修饰；强阳离子交换色谱；质谱 l方法原理 本方法的原理如图1 所示，首先对蛋白质进行还原烷基化和酶切，再通过胍基化反应保护肽段 中赖氨酸侧链韵氨基，通过酰化反应在其N 端引入磺酸基，然后通过反相色谱脱盐和强阳离子交换 色谱分离富集组氨酸肽，最后通过质谱进行肽段的序列分析。根据B e a u s o l e i l 等人I j j 的报道，在p H2 7 时，只有叶氨基、氨基、胍基和咪唑基带有电荷。胰蛋白酶酶切产生的肽段( 除部分末端肽C b ) ，几 乎都有N 端
4、的一个a 氨基和C 端的一个氨基或胍基，所以绝大多数肽都带有2 个以上的正电荷。 当肽的N 端氨基上引入带负电荷的磺酸基后，其C 端的正电荷即被中和，所以只有组氨酸肽会带上 与其所含组氨酸残基数相同的正电荷，非组氨酸肽所带净电荷数为零。因此，可以通过阳离子交换 色谱来分离富集组氨酸肽。 2 组氨酸肽的色谱分离与质谱鉴定 阳离子交换色谱的分离主要是基于被分析物所带的净电荷数【4 】，所以净电荷数为零的非组氨酸 肽在阳离子交换色谱柱上几乎不保留，而带有正的净电荷的组氨酸肽则可被保留，所以可以通过阳 离子交换色谱对组氨酸肽进行分离富集。将阳离子交换色谱分离组分进行脱盐处理和M A L D I T O
5、 F M S 分析，发现组氨酸肽能被有效的分离富集和鉴定，结果如图2 所示。 值得一提的是，本实验发现，除了组氨酸肽，含有漏切位点因而带有净的正电荷的非组氨酸肽 也被富集，提示优化酶切条件以减小漏切位点，可以提高本方法富集组氨酸肽的特异性。对于简单 样品，为了减小馏份数和缩短分离时间，可以采用阶梯梯度进行组氨酸肽的洗脱，但对于复杂样品， 应采用较缓慢的线性盐梯度对组氨酸肽进行洗脱与分离。 本文系国家自然科学基金( N o 2 0 5 0 5 0 1 8 ，2 0 6 3 5 0 1 0 ，2 0 7 3 5 0 0 5 ，2 0 8 7 5 1 0 1 ) 、国家重点基础研究发展规划项目( N
6、 o 2 0 0 7 C B 9 1 4 1 0 4 ，2 0 0 6 A A 0 2 A 3 0 8 ) 资助课题 “通信作者：钱小红，研究员，博士生导师，T e l ：( 0 1 0 ) 8 0 7 0 5 0 5 5e n t a i l ：q i a n x h n i c b m i a c c n 1 0 4 2 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 N - t e 帅I n l lC - t e r m i n a l p r o t e i n l H - l M 睁H K ，R _ 一c o o H I1 ) R e d u c t o n I2 ) A 崎l n
7、 o n 上3 ) T p b cd i g e s 在o t s d I a m dp P 廿d - - H H 2 2 N N 二一H 一“ 矾F J R l1 ) G u a 血d r l “o l I I2 ) s u l f o n a t i o n H I s t l d l n ec o r t t l l l n e dp e p t l d e le n r i c h e d I n dl d r l 堋c a U o n u I f o n 吐dp p t l d 厂 o J 珏L z - o 鼍兰：! ：，n o H f f Rz 一1 t L D - ，- o r
8、M s 。，。；。 - - - - - - t h ea m i n oe c i ds e q u e n c eT = h o m o m 触 o ：I l | 1 6 。咀撕S t o u p H = h i s t i d i n e K = l y s i n e z ：n e tc h a r g e R s r g m i n e 图1 磺化修饰辅助的组氨酸肽富集鉴定方法的原理 N t 2 - - l T J N H R “。 1 1 0 0 1 J 。| H 扣滞。 1 。L 1 。I 1 。ll1i I，1 tl 。- 图2 磺化修饰的肌红蛋白酶切肽段在离子交换色谱分离前(
9、a ) 、后( b ) 的质谱图 H 和N 分别代表组氨酸肽和非组氨酸肽，代表含有漏切位点的肽。 3 结论 本文选择标准蛋白为模型，对肽段磺化反应的条件进行了优化，并在此基础上提出了一种从蛋 白质混合物中富集鉴定组氨酸肽的新方法，本方法既可以降低肽段混合物的复杂程度，又可以提高肽 鉴定的可信度，在蛋白质组学研究中具有一定的应用前景。 参考文献 【1 】J iJ ，C h a k r a b o r t yAG o n gM ，Z h a n gX ，e ta 1 J C h r o m a t o g r BB i o m e d S c i A p p l ，2 0 0 0 ，7 4 5 (
10、 1 ) ：1 9 7 2 1 0 【2 】H a n s c nEL i n d e b e r gGJ C h r o m a t o g r A ，1 9 9 5 ，6 9 0 ( 2 ) ：1 5 5 1 5 9 【3 】B e a u s o l c i iS A , J e d r y c h o w s k iM ，S c h w a r t zD ，E l i a sJ E ，C ta 1 P r o c N a t l A c a d S c i U S A , 2 0 0 4 ，1 0 1 ( 3 3 ) ：1 2 1 3 0 - 1 2 1 3 5 【4 】 A l p c r tA J ，A n d r e w sP C J C h r o m a t o g r , 19 8 8 ，4 4 3 ：8 5 9 6 1 0 4 3
