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1、第5章 蛋白质的三维结构,一、研究蛋白质构象的方法 二、稳定蛋白质三维结构的作用力 三、多肽主链折叠的空间限制 四、二级结构：多肽链折叠的规则方式 五、纤维状蛋白质 六、超二级结构和结构域 七、球状蛋白质与三级结构 八、膜蛋白的结构 九、蛋白质折叠和结构预测 十、亚基缔合和四级结构,(Three-dimentional structure of proteins),一、研究蛋白质构象的方法,用 x 射线衍射（x ray diffraction ）研究蛋白质的构象时，蛋白质必须结晶。用波长很短的 x 射线照射蛋白质晶体，发生散射，底片曝光后，得到衍射图，再经计算机处理，绘出电子密度图，从中构建出
2、三维分子图像。,（x 射线衍射法）,抹香鲸肌红蛋白三维结构的x射线衍射研究,X射线衍射图 血红素部分的电子密度图,抹香鲸肌红蛋白三维结构的x 射线衍射研究,血红素结构与电子密度图的吻合 肌红蛋白中的血红素,肌红蛋白分子中部分肽链的电子密度图,核磁共振法,核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）波谱法利用各种多维核磁共振谱图,得到各原子之间的距离信息, 再结合蛋白质分子的共价结构, 经计算机计算得到分子的空间结构。此法可以测定溶液中蛋白质的构象，可用于研究蛋白质分子构象的变化、蛋白质分子的折叠、蛋白质分子与其他分子的相互作用等。,1H，13C，15N，19F，3
3、1P,肌红蛋白的一种二维氢谱,肌红蛋白血红素局部的结构,2,1,研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法,（紫外差光谱）,蛋白质中的Trp、Tyr、Phe等残基有紫外吸收，紫外吸收的指标有两个，即最大吸收波长（max）和摩尔消光系数（）。这些残基处于不同的微环境下时，它们的max和会发生相应的变化。环境极性增大会引起吸收峰向短波方向移动，称为蓝移，反之，引起红移。测定两个样品（同一蛋白溶液，条件有所改变，如pH、溶剂种类、离子强度或温度等）的紫外吸收光谱之差（差光谱），可以得知这些基团的微环境。,紫外差光谱,在极性溶剂中，如果蛋白质中某种氨基酸残基的max和大于游离存在的同一种氨基酸的max和，说明这
4、种氨基酸残基一定位于蛋白质分子的内部，并被非极性氨基酸残基所包围。如果蛋白质的紫外吸收光谱对溶剂的极性变化很敏感，则产生max和变化的氨基酸残基一定位于蛋白质分子表面。,Tyr在pH6和pH13的吸收光谱,Tyr是否处于解离状态可以通过紫外吸收光谱测出 Tyr 酚羟基的pKa=10.07,荧光测定,有些物质可以吸收某种波长的辐射，吸收的能量少部分转变成热量，大部分在109108秒内以较长的波长发出辐射，这种发出的辐射称为荧光。在蛋白质中，Trp和Tyr残基是主要的荧光基团，Phe残基也能发出荧光。它们的荧光max分别为348nm、303nm和282nm。这些残基的微环境的不同会导致max及荧光
5、强度的不同，根据其荧光变化可以得知其所处的微环境。,荧光分光光度计工作原理图,酪氨酸的吸收光谱 与荧光光谱,Trp、Tyr和Phe的荧光光谱,在中性水溶液中,荧光测定的指标,荧光分析的原理与紫外吸收分析有些相似。测定的指标是荧光max和量子产率Q。,荧光测定中猝灭剂的作用,通过加入荧光猝灭剂，如I 、Cs+、硝酸盐等，若能猝灭某氨基酸残基的荧光，说明该残基位于蛋白质分子的表面；若不能，则可能该残基位于猝灭剂进不去的蛋白质分子内部或较小的裂隙中，也可能位于能排斥猝灭剂的带电区域（猝灭剂与该区域带有相同的电荷）。,荧光测定中荧光探针的作用,荧光探针是一种能发出荧光的小分子化合物，如1-苯胺基-8-
6、磺基萘（ANS）、1-二甲基氨基-萘-5-磺酸盐（DNS）或其衍生物1-二甲基氨基-萘-5-磺酰氯（丹磺酰氯）。荧光探针可与蛋白质共价或非共价结合，再分析荧光探针的荧光变化，可知与荧光探针结合的部位处于何种微环境。,圆二色性,两个波长和振幅相等的平面偏振光，当它们的偏振面互相垂直，且相位相差90度时，可以合成为圆偏振光。圆偏振光有两种，一种是左圆偏振光，一种是右圆偏振光。当朝向光源方向看时，圆偏振光的电场矢量顺时针方向旋转的为右圆偏振光，反时针方向旋转的为左圆偏振光。当两种圆偏振光振幅相等时，合成为平面偏振光。当两种圆偏振光振幅不等时，合成为椭圆偏振光。,椭圆偏振和椭圆率,旋光度 椭圆率,圆二
7、色性,蛋白质分子具有不对称性，有些是构型不对称性，如氨基酸残基中的手性碳原子，有些是构象不对称性，如左手和右手蛋白质螺旋。手性物质对左圆和右圆偏振光的吸收不同（对光的吸收使光的振幅减小），当两种振幅相等的圆偏振光通过蛋白质溶液后，振幅变得不相等了，于是产生了椭圆偏振光。这种光学效应叫做圆二色性（circular dichroism，CD）。,圆二色性,左圆和右圆偏振光的电矢量分别以EL和ER表示，L 和R 分别表示手性物质对EL和ER光吸收的摩尔吸收系数，则= L- R 为圆二色性，圆二色性也用摩尔椭圆率 表示，这两种表示方式之间的关系为：,式中椭圆率 c =摩尔浓度，l =光程（cm）。 的
8、单位为度厘米2/分摩尔（degcm2/dmol）。 的值可以是正值，也可以是负值，当为正值时，叫正圆二色性；当为负值时，叫负圆二色性。,圆二色性,（当 很小时）,圆二色性,对于一定的蛋白质溶液来说，在不同的波长下有不同的 值，以 值为纵坐标，波长为横坐标，得出的曲线就是CD光谱。 在蛋白质的二级结构中，螺旋、折叠和无规卷曲具有不同的CD光谱，通过测定某一蛋白质溶液在几个波长处的 值，可以得知该蛋白质中这3种二级结构的比例。,多聚赖氨酸不同构象的标准远紫外CD光谱,圆二色性,假设蛋白质分子全由这3种构象单元组成，它们所含的残基数占蛋白质分子总残基数的百分数分别为f, f , f R，则 f f
9、f R = 1 。 再假设蛋白质分子中的各种构象单元在各个波长处的椭圆率也可以加和，则,式中 为实验样品CD曲线在波长处的摩尔椭圆率， 、 、 R 分别为100%螺旋、100%折叠片和100%无规卷曲构象在波长处的摩尔椭圆率，这些数据可由人工合成的多聚氨基酸获得（即标准值）。利用上述公式，只要测定三个不同波长处的 ，得到一个三元一次方程组，即可解得 f, f , f R 。,圆二色性,二、稳定蛋白质三维结构的作用力,稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一些所谓弱的相互作用，或称非共价键和次级键，包括氢键、范德华力、疏水作用和盐键（离子键）。这些弱的相互作用也是稳定核酸构象、生物膜结构的作用力。此外
10、，共价的二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要的作用。,稳定蛋白质三维结构 的作用力图示,盐键 氢键 疏水作用 范德华力 二硫键,稳定蛋白质三维结构 的几种键的键能,氢 键,由电负性强的原子与氢形成的基团如NH和OH具有很大的偶极矩，成键电子云分布偏向电负性大的原子，氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到附近一个电负性强的原子时，就产生静电吸引，即是氢键。氢键有两个重要的特征，一是方向性，受体 y与供体 x 之间的角度接近180；另一个是饱和性，在一般情况下，xH只能和一个 y 原子结合。,XHY,范德华力,范德华力包括3种较弱的作用力，即定向效应（取向力，
11、永久偶极矩）、诱导效应（诱导力，诱导偶极矩）和分散效应（色散力，瞬时偶极矩）。通常以分散效应作用最大。 范德华力包括吸引力和斥力两种作用，只有当两个非键合原子处于一定距离时吸引力才能达到最大，这个距离称为接触距离或范德华距离，它等于两个原子的范德华半径之和。,几种生物学上重要原子的范德华半径和共价键半径,疏水作用,疏水作用并不是成键。蛋白质溶液系统的熵增加是疏水作用的主要动力。仅从疏水基团相互聚集本身来看，这是有序化的过程，造成熵减少，不能自发进行。但这一过程涉及到水的熵增加，由于水的熵增加大于疏水基团熵减少的绝对值，过程总的熵变是增加的，可以自发进行。,疏水作用,当疏水化合物或基团进入水中时
12、，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构，即所谓的笼形结构，这种结构是高度有序化的。当疏水基团聚集时，笼形结构被破坏，这部分水进入自由水中，这样水的熵就增加了。,笼中包裹的是三丁烷基硫离子,胶束的形成,胶束的形成,胶束,疏水作用,在生理温度范围内，随着温度的升高，疏水作用加强，但超过一定温度后（5060）又趋减弱。 非极性溶剂、去污剂能破坏疏水作用，因此是变性剂。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，因此是强变性剂。,20种常见氨基酸的亲水指数,盐 键,蛋白质分子中可解离的基团解离后就带有电荷，异种电荷之间通过静电引力彼此吸引。盐键因加入非极性溶剂而加强（非极性溶剂的介电常数小，静电引力增
13、加），加入盐类而减弱。,二硫键,二硫键的形成并不规定肽链的折叠，而是折叠好以后，靠近的半胱氨酸之间形成二硫键。二硫键能够稳定三维结构。,三、多肽主链折叠的空间限制,完全伸展的肽链构象,示角和角,框内为一个氨基酸残基,几种不同的角和角,当和旋转键所在酰胺平面与H-C-R所在平面垂直，且该旋转键两侧的主链处于顺式构象时，规定= 0和= 0。从C沿键轴方向观察，顺时针旋转的角度为正值，逆时针旋转的角度为负值。,拉氏构象图,印度学者Ramachandran G N及其同事把肽链的原子看成是简单的硬球，根据原子的范德华半径确定了非键合原子之间的最小接触距离（允许距离）。并根据非键合原子之间的最小接触距离
14、，确定哪些成对的和是允许的，哪些是不允许的，作成了一个图，即拉氏构象图。,拉氏构象图,图中的阴影部分用白线封闭的区域是允许区，其它阴影部分是不完全允许区，阴影外的部分是不允许区。这些区域的定义适用于非甘氨酸残基，若是甘氨酸残基，允许的区域会大得多。Ramachandran等人测定了8个蛋白质的1000个非甘氨酸残基的角和角，将它们描在图中，可以看到，实际测定值和理论推导值还是相当吻合的。,可允许的和值 （拉氏构象图）,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,1.螺旋（helix）,螺旋是右手螺旋，螺旋中每个碳的角和角分别在57和47附近，每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm。
15、每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm。残基的侧链伸向外侧，不计侧链基团的螺旋直径为0.5nm。相邻螺圈之间形成氢键，氢键的取向几乎与螺旋轴平行。从N末端出发，氢键是由每个肽基的C=O与其前面第3个肽基的NH之间形成的。由氢键封闭的环是13元环，因此螺旋也称为3.613螺旋。,螺旋的各种图示,螺旋顶面观,外围的紫色小球为R基,螺旋中的氢键连接,十三元环,螺旋的偶极矩,C端积累了部分负电荷,N端积累了部分正电荷,影响螺旋形成的因素,一条肽链能否形成螺旋，以及形成的螺旋是否稳定，与它的氨基酸组成和序列有极大关系。R基小且不带电荷的多聚丙氨酸，在pH7的水溶液中能自发地卷曲成螺旋，但多聚赖氨酸
16、在同样的pH条件下不能形成螺旋，多聚谷氨酸也是如此。当pH变化到使这些多聚氨基酸不带电荷时，它们就能形成螺旋。,pH对多聚赖氨酸和 多聚谷氨酸构象的影响,影响螺旋形成的因素,R基太大也不能形成螺旋，如多聚亮氨酸。脯氨酸的CN键和CN都不能旋转，而且不具有酰胺氢，不能形成链内氢键。因此，多肽链中只要出现脯氨酸，螺旋即被中断，产生一个“结节”（kink）。,不常见的螺旋类型,蛋白质中还发现几种不常见的其它类型的螺旋。其中最常见的是310螺旋，还有4.416螺旋（螺旋）。,2. 折叠片（pleated sheet）,可以把折叠片想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成。每条纸片代表一条肽链，肽链沿纸条成锯齿状，碳原子位于折叠线
