磁性纳米四氧化三铁逆转SKOV3CDDP耐药性的初步研究

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1、东南大学 博士学位论文 磁性纳米四氧化三铁逆转SKOV3/CDDP耐药性的初步研究 姓名：姜智 申请学位级别：博士 专业：内科学 指导教师：陈宝安 20091201 中文摘要 中文摘要 磁性纳米四氧化三铁逆转S K O V 3 C D D P 耐药性的初步研究 东南大学临床医学院 博士研究生：姜智 内科学 导师：陈宝安教授 目的：本课题旨在研究磁性纳米四氧化三铁( F e 3 0 4 m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ， F e 3 0 4 M N P s ) 是否可以逆转人卵巢癌耐药细胞株( S K O V 3 C D D P ) 的耐药性，并

2、 探讨F e 3 0 4 M N P s 对S K O V 3 C D D P 耐药性的逆转作用与凋亡相关基因( Bc e l l l y m p h o m a l e u k e m i a2 ，B c l 2 ；S u r v i v i n ) 和核苷酸切除修复基因( e x c i s i o nr e p a i rc r o s s c o m p l e m e n t i n g1 ，E R C C l ) m R N A 转录的影响，并进一步检测P 糖蛋白 ( P - g l y c o p r o t e i n ，P - g p ) 、肺抗药性相关蛋白( 1 u n g

3、r e s i s t a n c e - r e l a t e dp r o t e i n ，L R P ) 和多药耐药相关蛋白( m u l t i d r u gr e s i s t a n c er e l a t e dp r o t e i n ，M R P l ) 表达水平，以探 讨它们逆转M D R 的作用机理，为载药纳米颗粒作为耐药逆转剂的临床应用提供理 论依据。 方法：将卵巢癌的耐药株S K O V 3 C D D P 细胞分为对照组、顺铂组( C D D P 组) 、 磁性纳米F e 3 0 4 颗粒组( F e 3 0 4 M N P s 组) 和C D D P

4、+ 磁性纳米F e 3 0 4 颗粒组( C D D P + F e 3 0 4 M N P s 组) 四个组。常规细胞培养，S K O V 3 C D D P 细胞与不同药物孵育后， ( 1 ) 采用甲基四唑蓝法( m e t h y l t h i a z o l y lt e t r a z o l i u m ，M T T ) 法检测对药物对细胞 增殖的抑制作用影响，计算出其I C s o 和耐药逆转倍数；( 2 ) 2 0I t m o l LC D D P 和2 5 l a g m L F e 3 0 4 M N P s 分别作用S K O V 3 C D D P 后，采用流式细胞

5、仪( f l o wc y t o m e t r y ， F C M ) A n n e x i n V F n c P I 双染法检测细胞凋亡率；( 3 ) 电感耦合等离子体原子发射 光谱法( i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a - a t o m i ce m i s s i o ns p e c t r o m e t r y , I C P - A E S ) 测定细 胞内铂含量检测细胞内C D D P 浓度；( 4 ) 采用半定量P C R ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p

6、o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，I m P C R ) 测定细胞B c l 2 ，S u r v i v i n 和E R C C1 基因m R N A 表达水平：( 5 ) 采用W e s t e r nb l o t 法测定P g P 、L R P 和M R P l 蛋白表达。 结果：( 1 ) C D D P 对S K O V 3 C D D P 细胞的抑制作用具有浓度依赖性，其I C 5 0 为 3 9 31I ，t m o l L 。C D D P 与F e 3 0 4 - M N P s 联合作用S K O V 3 C D D

7、P 细胞，细胞抑制率随着 C D D P 药物浓度增加而逐渐增强，其I C s o 为1 7 4p m o l L 。C D D P 与F e 3 0 4 M N P s 联合 作用S K O V 3 C D D P 细胞的逆转倍数为2 2 5 9 。 ( 2 ) C D D P + F e 3 0 4 M N P s 组和C D D P 组细胞凋亡率与对照组有统计学差异 东南大学博士学位论文 ( P 0 0 5 ) ( 见图3 、4 ) 。 4 0 8 10 3 1 3 n- 2 1 1 工口二 0 1 0 2 山! 乱n 鬈萋旋j ：o正呈1 P o p u ： 趣幽釜豳睁) 0 4 园0

8、 七二 曩日F 祭： 因。 I q g ，霸R _ | 嘲 。”i ：。”i ：- ：s 。园。 a n n e x i nVF I T C H园0 D A ：空白组；B ：2 0 t m o l LC D D P 2 1 日；C ：2 0 p m o l LC D D P + 2 5 p g m LF e 3 0 4 M N P s ； D ：2 5 1 x g m LF e 3 0 4 - M N P s 组 图3 不同药物作用4 8 d , 时对S K O V 3 C D D P 细胞捌广：牢的影响 96v墼磐幂 东南大学博士学位论文 零 V 糟 赆 对照纽C D D P 组F e 3

9、0 4 M N P s F e 3 罢踹。组 图4 不同组别中S K O V 3 C D D P 细胞凋亡率 注：P O 0 5 ，术与对照组相比；P 1 8 ) 。R T - P C R 步骤按照T a K 出a 试剂盒说明书 ( 见实验2 6 6 2 ) 进行。分别吸取2 “gR N A 样本，在2 0 - t l 反应体系中进行逆转录 反应，取逆转录产物5 山，使用P T C 一1 0 0 基因扩增仪进行P C R 扩增，P C R 反应体系 5 0 I d ：10 x P C R 反应缓冲液5 1 1 1 ，M g C l 2 ( 5 0m m o l L ) 1 5 9 l ，d N

10、 T P 混合物( 每种浓度 为1 0 m m o l L ) l 肛l ，上游及下游引物( 1 0p m o l L ) 各l g l ，D N A 聚合酶( S U L ) 0 3 1 土1 ， 加入灭菌水至5 0 9 l 。 $ - a c t i nm R N A 上游引物5 - T A T G A C ”r A G T T G C G 兀A C A C C 3 ，下游引物5 C C T T C A C C G T T C C A G l 限3 ，扩增片段长度1 5 5 b p ；S u r v i v i n m R N A 上游引物5 C A A G G A C C A C C G

11、 C A T C T C 3 ，下游引物5 C C A A G G G T T A A T T C T T C A A A C T - 3 ，扩增片段长度为2 5 5 b p ；b c l 一2m R N A 上游引物5 G G G A G A A C A G G G T A C G 触r A A 3 ，下游引物为5 C C A c C G A A C T C A A A G A A G G 3 ，扩增片 段长度为4 5 2 b p 。扩增条件为：9 4 0 C 预变性5 分钟，9 4 0 C 变性4 5 秒，5 5 0 C ( 以引 物序列后退火温度为主) 复性4 5 秒，7 2 0 C 延

12、伸1 分钟，反复循环3 5 次，7 2 。C 延1 9 i l l 0 分钟。取1 0 9 l 扩增产物与2 9 l6 x 缓冲液混合后，在1 5 的琼脂糖凝胶上电泳，用 I m a g e m a s t e rV D S 观察和扫描分析电泳图谱。用T o t a lL a b 软件分析P C R 电泳条带 光密度，内对照用p a c t i n 的比率计算，实验重复3 次。 2 3 半定量R T - P C R 检测核苷酸切除修复基因E R C C lm R N A 表达 同2 2 方法检N E R C C lm R N A 的表达。E R C C lm R N A 上游引物5 一C C

13、GC C A G C A A G G A A G A A A 3 ，下游引物5 C T G C C G A G G G C T C A C A A T - 3 ，扩增片段长度 2 7 6 b p 。扩增条件为：9 4 0 C 预变性5 分钟，9 4 。C 变性4 5 秒，5 8 0 C ( 以引物序列后 退火温度为主) 复性4 5 秒，7 2 。C 延伸1 分钟，反复循环3 5 次，7 2 0 C 延伸l O 分 钟。 2 4W e s t e r nb l o t 方法检N P - g p 、L R P 和M R P l 蛋白 蛋白质印迹分析( W e s t e r nb l o t )

14、参照分子克隆第3 版中蛋白质的S D S 聚丙 烯酰胺凝胶( S D S P A G E ) 电泳方法，制备1 0 的分离胶，样品中加入上样缓冲液 后于1 0 0 0 C 加热3 分钟使蛋白变性，加入上样孔，8 0v 进行S D S P A G E 电泳3 小时后，于电转移槽中5 0m A 电流的条件下将蛋白转移至硝酸纤维素( N C ) 膜 第二章磁性纳米F e 3 0 4 逆转卵巢癌S K O V 3 C D D P 细胞耐药性的机理 上。转移后的N C 膜于3 脱脂牛奶中封闭3 0 分钟，室温下于相应抗体中孵育9 0 分钟；洗涤后，加A - 抗室温孵育6 0 分钟；于E C L ( P

15、i e r c e ) 试剂中作用1 分钟， 于暗处对X 光片曝光并冲洗光片。灰度扫描并进行数据统计分析处理。 3 实验结果 3 1I C P - A E S 法分析S K O V 3 C D D P 细胞内铂含量 取对数生长期的细胞，如上分为四组：空白对照组、C D D P 组、F e 3 0 4 一M N P s 组和C D D P + F e 3 0 4 M N P s 组。分别作用S K O V 3 C D D P 细胞4 8 d , 时，I C P A E S 法测 定S K O V 3 C D D P 细胞内铂含量：C D D P + F e 3 0 4 M N P s 组细胞内药

16、物浓度 ( 0 0 7 4 0 a ：0 0 0 5 7 ) 较C D D P 组( 0 0 5 7 0 - a ：0 0 0 3 0 ) 增加，其差异有统计学意义 ( 尸 0 0 5 ) 。C D D P 组矛I C D D P + F e 3 0 4 M N P s 组S u r v i v i n 和B c l 2 m R N A 表达与对照组相比均有下调( P 0 0 5 ，# 与对照组相比；P 0 0 5 ，与对照组相比，且2 0 岬。儿C D D P + 2 5 t g m LF e 3 0 4 M N P s 缬I 各种蛋白与t 3 一a c t i n 灰度比值均小于2 0 1 x m o l LC D D P 组。 4 小结 ( 1 ) 在本章的研究中通过W e s t e r nb