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1、 第二章蛋白质化学 第二章蛋白质化学本章内容第一节 蛋白质的建筑构件氨基酸第二节 蛋白质的共价结构第三节 蛋白质的高级结构第四节 蛋白质结构与功能的关系第五节 蛋白质的理化性质第六节 蛋白质分离与纯化技术 第五节、蛋白质的理化性质蛋白质的化学反应和氨基酸的一样，游离的a-氨基、a-羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。一、两性解离性质及等电点二、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质的紫外吸收特性六、蛋白质呈色反应 一、两性解离性质及等电点+ OH-NH2+ OH-NH3+NH3+PrCOO-PrPr+ H+ H+COO-COOHpH pI净电荷为负当蛋白
2、质溶液在某一定 pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为兼性离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的 pH值即为该蛋白质的等电点（Isoelectric point，pI）n酸性AA与碱性AA的比值n中性盐的影响：可解离基团与Cl、Mg- 2+ 等电点时特点（1）净电荷为零（2）一定离子强度的缓冲液（3）多数蛋白质在水中等电点偏酸碱性AA/酸性AA比例 等电点胃蛋白酶 0.2血红蛋白 1.7细胞色素C 2.91.06.710.78.2菊糖酶0.34（4）在等电点时蛋白质的导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。 二、蛋白质的胶体性质根据溶质在溶剂中的颗粒大小（分散
3、程度），可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于l100nm的为胶体溶液。分散相质点在胶体系统中保持稳定，需具备3个条件：p分散相质点大小在l-100nm范围内，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中不断作布朗运动；p分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；p分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。 二、蛋白质的胶体性质由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成 1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和
4、性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。 蛋白质胶体性质的应用透析：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在透析袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。超滤：是利用外加压或离心使水和其他分子通过半透膜，蛋白质留在膜上。超滤主要用于蛋白质分子的浓缩、脱盐等。 三、蛋白质的沉淀蛋白质分子凝聚并从溶液中析出的现象，称为蛋白质沉淀(precipitation)。变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变
5、性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有三种稳定因素：颗粒表面的水化层；电荷；布朗运动。除去前两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。 常用的沉淀方法：(一)盐析(Salting Out)在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性（中和电荷的同时破坏水化层）而使其析出，这种方法称为盐析。常用有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。(二)重金属盐沉淀蛋白质蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，当蛋白质分子带较多的负离子时，更易进行。(三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯
6、乙酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，当蛋白质带正电荷时，易于与酸根负离子结合成盐。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。 常用的沉淀方法：(四)有机溶剂沉淀蛋白质向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。(五)加热凝固加热蛋白质溶液，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。e.g.将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量 盐卤（含 MgCl2）制作豆腐。 四、蛋白质的
7、变性与复性某些物理因素和化学因素，使蛋白质分子的空间构象被破坏，并导致蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，这种现象称为变性作用（denaturation）。其本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而并不涉及蛋白质一级结构的改变或肽键的断裂。n生物活性的丧失是变性的主要表现；n构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。 四、蛋白质的变性与复性物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等（表面张力）化学因素：强酸和强碱（破坏解离状态等）、尿素和盐酸胍（竞争氢键）、去污剂（破坏疏水键）、浓乙醇（破坏疏水2+ + 2+键等）、重
8、金属盐（如Hg 、Ag 、Pb 等）等。表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和生物化学性质（易被蛋白酶分解）改变。蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。 核糖核酸酶变性与复性作用8 M脲，巯基乙醇变性透析复性天然状态还原变性状态 五、蛋白质的紫外吸收特性蛋白质在远紫外光区（ 200-230nm）有较大的吸收，在280nm 有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。注意事项：测定范围 0.10.5mg
9、/mL经验公式法：蛋白质质量浓度（mg/ml）= 1.55A 2801cm- 0.76A1cm260 六、蛋白质呈色反应1、茚三酮反应NH2末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量反应，生成有色物质，可用于蛋白质的定性、定量分析。2、酚试剂反应蛋白质可以与酚制剂（如Folin酚）发生反应生成蓝紫色化合物，可以用于蛋白质的精确定量分析。3、双缩脲反应是肽与蛋白质所特有、而氨基酸则没有的一个颜色反应。含有两个或两个以上肽键的化合物，与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，可用于测定蛋白质的含量。 蛋白质的颜色反应 第二章蛋白质化学本章内容第一节 蛋白质的建筑构件氨基酸第二节
10、 蛋白质的共价结构第三节 蛋白质的高级结构第四节 蛋白质结构与功能的关系第五节 蛋白质的理化性质第六节 蛋白质分离与纯化技术 第六节 蛋白质分离与纯化技术一、蛋白质分离、纯化一般原则二、蛋白质分离、纯化方法三、蛋白质含量测定和纯度鉴定 一）蛋白质分离、纯化一般原则对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品。蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为：1、前处理2、粗分级分离3、细分级分离 1、前处理分离纯化某一蛋白质，首先要将蛋白质从原来的组织或者细胞中以溶解的状态释放出来，并
11、保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料：剔除结缔组织及脂肪组织种子材料：去壳、去种皮、脱脂破细胞动物组织或细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理植物组织和细胞：存在细胞壁（纤维素、果胶等），利用石英砂、玻璃粉以及适当的提取液研磨，或用纤维素酶处理细菌细胞： 超声震荡、研磨、溶菌酶处理如果目的蛋白质集中在某一细胞器中，如细胞核、染色体、核糖体、可溶性细胞质等，则可以采用差速离心的方法对相应的细胞组分进行富集。 不同离心场下沉降的细胞组分相对离心场（g）1000时间（min）沉降的组分真核细胞5400010叶绿体、细胞碎片、细胞核线粒体、细菌15 000203030 000溶酶体、细菌细胞碎片
12、核糖体100 0003 10（h）相对离心场（Relative Centrifugal Field, RCF），以重力加速度g（980.66 cm/s ）2的倍数表示。4 p3600 x 980其中：离心机转数为（r/min）r为平均半径，以cm为单位，指离心机旋转轴到离心管中间的距离(r/min)2r2= 11.19 x 10 (r/min)-5 2rRCF = 2、粗分级分离粗分级分离（Rough Fractionation）：当蛋白质提取液获得以后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等特点：简便、处理量大，既能除去大量杂质
13、，又能浓缩蛋白质溶液。蛋白质溶液浓缩方法：超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥、聚乙二醇，等 3、细分级分离细分级分离（Fine Fractionation）：样品经过粗分级分离后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去，需要对样品进行进一步纯化。常用的方法：1、层析法：包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等；2、电泳法：包括区带电泳、等电聚焦等特点：规模较小，但分辨率很高 二、蛋白质分离、纯化方法蛋白质分离纯化的方法，是以目的蛋白质与杂蛋白或其他杂质成分在溶液中下列性质的差异为原理的：1、分子大小2、溶解度3、带电荷性质4、吸附性质5、对配体分子的生物学亲和力 1、根据分子大小不同的纯化方法1）透析和超（过）滤2）密度梯度（区带）离心3）凝胶过滤 1）透析和超（过）滤透析袋透析（ dialysis）：利用蛋白质分子不能通透析液过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。搅拌子常用的半透膜是玻璃纸（赛璐玢纸）、火棉纸（赛璐琔纸）以及其它改进型的纤维素材料。磁力搅拌器透析装置示意图超过滤（ultrafiltration）：利用压力或者离
