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1、中国协和医科大学 硕士学位论文 硫代反义寡核苷酸在鸭体内外对DHBV DNA复制的影响及高通量 荧光底物HIV-1蛋白酶模型的建立 姓名：董飚 申请学位级别：硕士 专业：微生物与生化药学 指导教师：陶佩珍 20040701 中国协和医科大学硕士研究生论文 缩略语一览表 A I DSAcqu ir e di m m uno de f ic ie n c y s Y ndr o me D H B VD i lc khe Pa t i t is Bv ir i ls D MS 0D i me t h Y IS u l P h o x ide D T TD j t h jo t hre i t0 1
2、E D T A E t h y l e ned ia m in ot e tra ce t icac i d E c o l iEs c h e r ic h i 8 c o l i F R E Tf 1 1 1 0resce n c ereso na n c ee ner g y tr a l 7 1 s f er H I V hu ma 1 1i m m u l 2 0d e f ic ie n c Y v ir us H B V HP L C 】P T G M E S O P C O D P BS P E G R Nase T A E T E Tr is he Pa t i t is B
3、V ir us H i 9 1 1 P e f f 0 1 - ma n c 。L iqu i d Chr o ma t o g ra P h Y 1soPro pY 1 - p - t h iog a Iac t o PYr a n o s ide 2 - ( N M or P h o I in o ) e t h ar l esu l f o n ic ac id 0 I i g o nuc 1e o t ide P i lr i f i c8 t io n car tr id ge 0 P t i ca 1der ls i t Y P h o sP ha t ebu f f ereds
4、a l ine P0 1Y e t h YJer l0 9 1 y c 0 1 R ib0 1 3uc 1e ase Tr is a c e t a te E D T Ab u f f e r Tr is H C l ，E D T AB 1 1 f f er Tr ih Ydr o x Y m e t h y l a m i l 3o me th a ne 3 得性免疫缺陷综合 乙型肝炎病毒 甲基亚砜 硫苏糖醇 二胺四乙酸 肠杆菌 光共振能量转移 人类免疫缺陷病毒 艾滋病病毒 乙型肝炎病毒 高性能液体色谱 异丙基硫代一B D 一半 乳糖苷 2 ( N 一吗啉) 乙基 磺酸 寡核苷酸纯化柱 光密
5、度 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 核糖核酸酶 T A E 缓冲液 TE 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 获症鸭二一一乙大荧 中国协和医科大学硕士研究生论文 中文摘要 人类免疫缺陷病毒( H IV ) 和人乙型肝炎病毒( HBV ) 感染是目前 对人类威胁最大的两种病毒性传染病。H IV 在感染后，经过至多 十年的潜伏期后，会发展成获得性免疫缺陷综合征( A IDs ) ，绝 大多数患者最终会由于并发各种感染或肿瘤而死亡；人乙型肝炎 病毒可使患者长期处于低生活质量的状态，后期患者可发生肝硬 化肝癌等病变，最终影响到人们的生存。本论文分两部分针对这 两种病毒的化疗，即应用硫代反义寡核苷酸抑制肝炎病毒和采用 化
6、学合成药物抑制HIV 蛋白酶进行了研究。 首先，以鸭乙型肝炎病毒( D H BV ) 为模型，研究在D HB VDN A 转录起始区域设计硫代反义寡核苷酸抑制D H BV D N A 复制的可行 性。设计合成了分别基于D H B VPreS1 、Pres2 、S 抗原启动基 因的硫代反义寡核苷酸，经0 PC 柱纯化后，用于效果鉴定。应用 S0u ther nb l0 t 实验和CPm 计数测定其对原代鸭肝细胞中及雏 鸭中感染D H BV 的DHBVD N A 的作用。结果表明在1 5 p n lo1 L 浓度下，体外抑制率分别是61 5 ，69 3 和62 4 。选取 PreS1 抗原基因起始
7、区段的硫代反义寡核昔酸进行大量合成，经 se 口hadexG 一25 柱纯化后用于整体动物实验。每只动物每天按 10ug g 体重静脉注射一次，共给药6 天。对动物肝脏进行取样 分析表明，在此剂量下，对D H BV DN A 的抑制率可达8 7 9 。结 果表明，我们所设计的针对转录起始区的硫代反义寡核苷酸在体 内外对DHBV D NA 复制均有明显抑制作用，说明了在这一区域设计 硫代反义寡核苷酸的可行性。 由于目前蛋白酶抑制剂被证明是抗H IV 的较为有效的药物。 通过将P 1 00 W 表达载体转化入E C0 j 细菌细胞，在I PTG 作用 下，使其表达出包涵体形式的H IV 蛋白酶融合
8、蛋白，进一步用尿 素分离，C ellu1ose C m 柱子色谱纯化，制备出自剪切后之成熟 的H Iv 一1 蛋白酶。建立、比较两种测定酶活性( H PL C 酶切分析 法及荧光底物法) 方法，并对酶反应体系进行优化。通过测定K I l l 中国协和医科大学硕士研究生论文 值及已知H IVPR 抑制药的ICs 。对酶进行鉴定。应用荧光方法建 立高通量筛选模型，并顺利进行了7 000 个微生物产物及其它样品 的筛选。使研究者可以高效、快速、灵敏、大量的筛选抗HIV PR 样品。 【主题词】硫代反义寡核苷酸；鸭乙型肝炎病毒；HIv 一1 蛋白 酶；高通量筛选 中国协和医科大学硕士研究生论文 A b
9、 s tr ac t S tudy ing Inh ib i t ionO fD HB VDN Arep l ica t ion w i th an t isense phO sphor o th ioa t eO I igodeox ynuc IeO t ide s and es tab I sh Ingtheh ighthr Ou 口hpu tscreen ingmode If or H I V - 1Or o teaseinh ib i tors Hu mani m munode f fc iencyv irus ( H I V )andhu man hepa t I t IsBv ir
10、usar ebO ththemOs t in t i m ida tory in f ec t ious d isea8est othehu manb e ingA f t erin f ec t ionO f H I V ，e igh t lO Ien year Ia Ien t p er IOdw i l lbef o I lo w ed Andtheni tw i l l be progr e ss edeven Iur e | | yin IOthe ac qu ir e d i m munode f ic iency syndr o m e ( A fDS ) P a t i e n
11、 tsw i I Id ief ina f fybyv ar ious oppOr tun is t jcin fec t ionsasV irusorbac ter ia in f ec t ionor tu morA I thoughsuch seVerea f ter ma thw - l In0 tbe ap p eared jncaseO fHB Vin f ec t IOn theHB Vcarr jer pa t ien ts w i | II ive l 九aIO w qua l i Iy l i f e8 t y Ie S i m j I art OH I V pa t i
12、en ts ，HB V pa t i e n fsw i | Ia IsOsu f f erfr o mthesev er esyndr O mesuchas hepa t oc jr rhOs isandI i verc ancerdur ing Ia te per i Od Un fOr tuna te lytherear emorethan120m I | ioncarr ierso f HB Vv irus mean wh i Ie p eO p Ie hav ingb eenin fec tedb y HB V v irusaremu l t i 口Ie Ihea mOun tThe
13、r e fOreHB VismOre fhr e a t enthanHJ Vt och ines er ec en Iy Jnth js p aPer ，w e d iscussan t isense pho sphor o th iOa teo l igodeo xynuc I eO t ides andnove Iche m ica Isaga ins tDHB VandH l V pr O te ase respec t Iy br ie fJ y f irs t w es tudythecharac ter is t jc0 f an t isense phO sphOr O th
14、iOa te O l igO de Oxynuc IeO t ides jnh ib j t jngtheD N A r e p J jc a l jOno fD HB V jnV jv oandjn v i trO Sec Ond Iy a f terexpr ess ingand pur i f ica t ion o fH I V 6 中国协和医科大学硕士研究生论文 pro t e ase theinh i b i tab i | i tyo fche m jca Ic o m pO unds des ignedonCa lano I jde isde tec ted Tode t er
15、 m inethefeas b iJ i tyo finh b i t lono fDHB VDN A rep I ica I lOnbyan l isense phO sph0rO th iOa teO I igO deO yn uc Jeo l idesana lO gues corr espond jng tOduck hepa t i I isBv irus ( DHB V )lra 九scr ip l ionr eg ion we des igned threean t isense ph0 sphOrO th ioa teO I igodeOx yn uc Ie0 l ides a
16、na Iogueswh ichcOr respondtoDHB VPr e S l ，PreS2andS an t jgen genep ro mo terrespec t iVe ly TheDN Ar ep f ica t ion Ieve lwasde Iec ledw i lhSou thernb lo tme thodandcD m ca lcu la t ion The ex 口er i men l resu I ls sh0 wIha ltr ea Iedw l th 1 5 “mO I ，L an t jsenseo | igodeoxynuc Ieo t idesin pr l mar y duck hepa t Ocy t ecu I ture巾y ，fr o ， a f fo fthean “sense frag men ts causedaf ir m lnh ib i t j0ne f f ec to fv ira IDN AreD I lca t ionT
