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1、高度不均一样中单病毒种的全基因组测序,刘张坤 20151022,摘要：,宏基因组学研究表明：存在于自然界中的病毒，只有一小部分被鉴定和研究了。 未知病毒的表征被存在于微量病毒样品中的许多基因组阻碍。 新报道的一种方法：使液滴状微流体和计算分析一体化，实现来自复杂混合病毒样品中单病毒种的纯化和恢复完整的基因组序列。,通过用这个平台，一个5243 pb的双链DNA病毒的基因组序列（在废水中）恢复了96%以上的序列范围和99.8以上的序列特性。 这种方法有希望用于病毒探索，因为它能富集和测序以前未知和已知的病毒。,背景,尽管病毒无处不在并且有影响力，但是只有少于万分之一的病毒被测序了。对于鉴定潜在的
2、新发传染病和提升我们对病毒多样性、生态学、适应性、进化的理解来说，建立庞大的病毒数据库是至关重要的。,表征未知病毒基因组的主要路障： 缺少富集不同种类病毒的技术。 环境样品含有不同的病毒种群；临床样品中，病毒基因组量和宿主基因组量相比是很低的，并且病毒粒子定位在组织细胞的一小块区域。对于这些样品，富集靶标病毒种是必须的,传统富集方法： 细胞孵育、免疫筛选，然后进行独立序列的PCR扩增和差别杂交 缺点：工作量大，无效率，只适用于一小部分病毒,近来建立的一种流式细胞术： 能分散单病毒粒子到微孔中并获得他们个体的基因组序列 缺点：没采用选择的策略。 选择的策略：能实现测序能力有效利用，实现合理测序费
3、用和时间下的稀有病毒的测序,液滴状微流体优点,实现单细胞或高敏感病毒的高效筛选 时间最少化 通过联合液滴数码PCR和微流体分类技术，实现选择性富集环境样品中的靶标病毒,主要工作,建立一个平台，平台将液滴状微流体（用于单病毒分析）和分类，挑选出的病毒的全基因组放大的分子生物学技术，以及病毒基因序列的重头测序组装的计算工作流融为一体。 实现从一个大的病毒序列的基因空间中分离并测序任何单病毒种。,病毒粒子荧光图（说明分散性很好）。 离心后上清样，病毒离子被染色，在氧化铝过滤器上制样。,引物（未知/已知病毒）设计,重叠群,Illumina Platform用于测序 sequence reads恢复分类
4、的病毒的基因序列 计算工作流用于序列数据的清理，重头组装，和靶标病毒重叠群的筛选。 CLC汇编器移走低质量序列和人类序列并把剩下的序列组装成重叠群 来源于未知生命体的高质量重叠群（相对丰度最高）决定被富集病毒的基因序列,环境样品病毒基因鉴定 a)病毒封装进液滴 b) 热循环后扩增子在包含靶标病毒的液滴中生成 c) 根据液滴荧光强度对其进行分类 d)用USER处理富集的病毒溶液，消化扩增子 ，随后全基因扩增 e) 用计算工作流对扩增产品测序和组装 液滴中包含病毒样，PCR缓冲剂，引物，绿色荧光蛋白I，dUTP/dATP/dGTP/dCTP,评估平台的测序能力,表征好的病毒SV40，加入到废水中，
5、通过微流体平台的筛选，测序富集的样品，执行重新组装。研究组装序列与SV40基因序列是否匹配，组装序列能覆盖SV40基因序列的比例。,*这个引物用来评估SV40 溶液中SV40病毒粒子的浓度和USER ，MDA处理之后从SV40/废水混合物中富集SV40 。 * 这个引物用于未经USER 处理，经过MDA后从SV40/废水混合物中富集SV40,a) 制液滴设备的局部成像 b) PCR之后液滴的荧光成像。荧光来自于插到扩增子中的绿色荧光蛋白c) 分类设备的局部成像。 依据荧光强度来选择液滴。 比例尺50 mm。EX=470nm,预检测（荧光液滴是否含有靶标基因）：限制酶切分析,a) PCR后，51
6、9 bp SV40扩增子产生，这些扩增子含有dUTP ，USER处理后降解。 b, c) 限制酶切分析核实SV40基因序列的扩增 b) 限制酶处理后，SV40 基因序列分为1446,1790, and 1997 bp三段. c) 至少需要100 个PCR阳性的液滴才能用MDA检测到 SV40 基因序列。,进一步评估纯化和扩增的方法,对扩增的DNA进行测序和分析,a 这个序列缺少一个17612259 bp的扩增序列. b 用MDA试剂，净化不完全。 c在107250 bp范围的两个 72 bp 的重复序列.,证实：微流体平台有效地从病毒复合物中富集靶标病毒 丢失基因序列的可能原因：消化产生的扩增
7、子碎片退火到SV40序列上，阻碍了DNA的链延长。,扩增子消化过程的重要性,a) SV40 基因全序列. b) 缺少一个大序列(17612259). c) 在MDA之前，259 bp (237495) 扩增序列未消化. 测序显示只包含扩增序列。,在各种情况下，重叠群与源基因序列相对丰度高度匹配,结论,用这个平台，至少收集100个病毒粒子能检索到97%的基因组序列。 尽管这个平台是为DNA病毒设计的，但同样能用于RNA病毒。 我们的平台有希望用于未知病毒的测序。人类鼻病毒重叠群50-65%的序列同源性。 我们的平台能从其他病毒的混合物和DNA污染物中有效地分离单个病毒粒子。无需孵育病毒，有望用于病毒探索和扩展基因库。,
