白菜花粉发育相关的PGIP新基因BcMF19的克隆与表达分析

《白菜花粉发育相关的PGIP新基因BcMF19的克隆与表达分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白菜花粉发育相关的PGIP新基因BcMF19的克隆与表达分析（88页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 白菜花粉发育相关的白菜花粉发育相关的 PGIP 新基因新基因 BcMF19 的克隆与表达分析的克隆与表达分析 作者姓名作者姓名 刘刘 颖颖 指导教师指导教师 曹曹 家家 树树 教教 授授 学科学科(专业专业) 蔬蔬 菜菜 学 学 研究方向研究方向 植物基因组及其分子调控植物基因组及其分子调控 所在学院所在学院 农业与生物技术学院农业与生物技术学院 提交日期提交日期 2010 年年 1 月月 10 日日 Cloning and Expression Analysis of a Novel Polygalacturonase Inhibitory Protei

2、n Gene BcMF19 in Brassica campestris ssp. chinensis By Ying LIU A Dissertation Submitted as Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master with Major in Plant Genome Brassica campestris ssp. Chinensis; Brassica rapa ssp. Chinensis; BcMF19; PGIP; pollen development; Male sterility;

3、gene cloning; gene expression; RT-PCR; in situ hybridization 浙江大学硕士学位论文 白菜花粉发育相关的浙江大学硕士学位论文 白菜花粉发育相关的 PGIP 新基因新基因 BcMF19 的克隆与表达分析的克隆与表达分析 1 0 引言引言 芸薹属植物为异花传粉植物，具有非常明显的杂种优势，是杂种优势利用潜力很大的一类作物。 白菜（Brassica campestris ssp. chinensis, syn. B. rapa ssp. chinensis）核雄性不育两用系自 20 世纪 80 年 代育成以来，已在一代杂种生产应用中发挥了重要

4、作用。研究结果表明，白菜雄性不育涉及到育性基 因在一定时空上的表达与否，以及体内因子对这种表达的影响和调控等因素。由于花粉发育在有性生 殖过程中发挥重要作用，与雄性不育紧密相关，并且花粉的形成过程恰好展示了细胞发育的微观世界， 是研究细胞生长、分裂、分化和细胞间信号转导等过程的理想模型。现在已经在很多物种中发现了花 粉中特异表达的基因，但无法与估计的上千个花粉发育特异基因相比（Willing et al, 1988） ，花粉发育 相关基因表达的动态过程和系统性调控、雄性不育发生的启动和调控等机理仍然是个谜。 近年来，随着对模式植物拟南芥花粉发育突变体的鉴定及对应基因的分离的迅速发展，越来越多

5、的拟南芥花粉发育的相关基因的功能得到到确定（Jiang et al, 2005a） 。白菜的花器官较大，并且花粉易 于收集，基因组序列与拟南芥（Arabidopsis thaliana Heynth）有 87%的同源性，是研究花粉发育分子机 制的好材料。在实验室前期研究中，培育了遗传性状稳定的白菜 矮脚黄核不育（Aijiaohuanggenic male sterility）两用系Bcajh97-01A/B。该系统其不育株和可育株分离比例为 11，育性由一对隐性等 位基因控制， 遗传背景简单， 不育株为雄性减数分裂的胞质分裂突变体 （male meiotic cytokinesis，mmc）

6、， 其花粉减数分裂末期胞质分裂异常，不能形成四分体而导致没有正常花粉粒形成，导致雄性不育。在 国家自然科学基金委和浙江省科技厅的资助下，本实验室利用 mRNA DD-PCR（mRNA differential display）技术、cDNA-AFLP 技术分别与 RACE 技术和以同源序列为依据的扩增技术结合，从普通白菜 中发现了与花粉发育相关的基因 CYP86MF （王玲平等， 2005; Yu et al, 2003） 、 BcMF1 （王华新等， 2008）、 BcMF2（Wang et al, 2005）、BcMF3（王永勤等，2004；刘乐承等，2007）、BcMF4（Liu et

7、al, 2007；刘 乐承，2006a 和 2006b）、 BcMF 6（张强等，2007; Zhang et al, 2008）等，其中包括多聚半乳糖醛酸酶 基因、果胶甲酯酶基因、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因和一系列花粉外壁蛋白基因，并对他们在花 粉发育过程中的功能进行了比较详细的分析。 黄鹂（2007）采用 cDNA-AFLP 技术对白菜花粉转录组的分析中发现了 38 个在白菜野生型花粉中 特异表达的 TDFs（transcript-derived fragments） 。它们大多参与花粉壁的合成和调控、转录调控、信号 转导等一系列与生命过程相关的基因有较高的同源性，对这些片段的表达模式分

8、析表明这些基因在花 粉发育的不同阶段特异表达。其中有一个差异片段 A14T7，与突变体不育株相比，在 mmc 突变体的野 生型可育株花蕾中上调表达，推测这个差异片段与花粉发育密切相关。通过 NCBI 的比对发现，该差 0 引言引言 2 异片段与拟南芥 FLOR1 基因有 81%的相似性， 而参与花器官发育的胞内 LRR 蛋白 FLOR1 是首个被分 离的花特异的植物 LRR 蛋白， 与属于 C 类基因的 MADS-box 转录因子 AGAMOUS 有直接的调控关系， 并仅在花粉发育过程的前期有表达 （Acevedo et al, 2004） 。 在花粉中也发现另一些 LRR 蛋白， 例如 RP

9、K2 通过激发绒毡层的降解而控制着绒毡层细胞的命运，RPK2 的 mRNA 在花粉囊的绒毡层中大量存在， RPK2 的突变型由于中断了主要的代谢过程从而破环了正常的花粉成熟和花粉囊的开裂（Mizuno et al, 2007） 。根据蛋白的结构和功能的不同，植物 LRR 蛋白主要可以分为类受体蛋白激酶（receptor-like protein kinase, RLK） 、抗病基因（resistance gene, R gene）编码的蛋白、PGIP 和其它的植物 LRR 蛋白 等四大类（杨崇林和陈章良，1997） 。虽然植物 LRR 蛋白基因占拟南芥基因组 1%以上（Young, 2000）

10、 ， 但至今功能明确、 参与花粉发育的植物LRR蛋白基因的研究报道甚少。 NCBI的比对结果还发现， A14T7 与其他 PGIP 有 60% 75%的同源性。 但是在现有的研究成果中研究 PGIP 基因主要集中在抗逆性研究， 参与花粉发育的PGIP基因很少。 实验室前期的工作中也发现了一个花粉发育特异的PGIP基因BcMF4， 经过反义 RNA 和 RNA 干涉技术得到 BcMF4 沉默的转基因植株，推测该基因参与了花粉的细胞质或 细胞器发育过程。作为与花粉发育相关的差异片段，A14T7 是否也是 LRR 蛋白基因，属于 LRR 家族 的哪一类以及表达特征与生物学功能等问题，需要深入研究。

11、为了认识该片段基因的结构和表达特征，为进一步研究其功能打下基础，在实验室前期工作的基 础上， 本研究以上述白菜矮脚黄核不育两用系Bcajh97-01A/B为材料， 通过 RACE 和同源扩增克隆到 A14T7 的基因全长，进而分析其基因全长进行序列分析及蛋白质结构和功能预测，采用 RT-PCR 技术 验证该基因在不同发育阶段的生殖器官和营养器官中的表达情况，并通过原位杂交技术进行该基因的 细胞学定位，进一步明确其表达模式，初步明确其在白菜花粉发育过程中的作用，为深入探索芸薹属 作物花粉发育的分子机制提供实验依据。 浙江大学硕士学位论文 白菜花粉发育相关的浙江大学硕士学位论文 白菜花粉发育相关的

12、 PGIP 新基因新基因 BcMF19 的克隆与表达分析的克隆与表达分析 3 1 文献综述文献综述 1.1 花粉壁的发育花粉壁的发育 被子植物的花药是由雄蕊原基分化出来的，花药最初由三层细胞组成，其中第一层细胞分化成花 药的表皮层。第二层细胞分化形成孢原细胞，第三层细胞则分化发育为药隔及维管束等组织（Goldberg et al, 1993；Sanders et al, 1999） 。第二层的孢原细胞经过平周分裂会产生外层初生周缘细胞和内层初生 造孢细胞：初生造孢细胞再次分裂形成小孢子母细胞，小孢子母细胞经减数分裂形成小孢子；初生周 缘细胞则经平周分裂产生次生周缘细胞，次生周缘细胞进一步分化发

13、育，形成由外向内的药室内壁、 中层和绒毡层，这三层细胞共同构成了花药囊壁。参照 Sanders 等（1999）对拟南芥花粉囊的发育阶段 划分， 小孢子母细胞在阶段 5 7 进行减数分裂， 分化成四分体， 此时花粉囊的四层细胞已经分化完全， 单个小孢子在第阶段 8 时分离出四分体，花粉粒形成是在阶段 11。花粉粒开裂是在阶段 12 13。中绒 毡层开始空泡化是在阶段 6 之前，开始解体是在阶段 9 之后，然后到阶段 13 彻底降解完全。花粉囊内 皮（有可能出现次级细胞壁）的增厚，在阶段 11 13 可以观察到。 一般情况下，将花粉壁分为花粉外壁和花粉内壁，花粉外壁由外壁外层和外壁内层组成，外壁外

14、 层主要由柱状层和覆盖层构成，而且花粉外壁外层和外壁内层的形态特征变化很大，属于花粉壁结构 特征中最具代表性的部分（Stanley and Linskens, 1974） ，其代表了物种的特异性。构成的花粉外壁的孢 粉素是一种难以分解的物质，它是由花药绒毡层提供的，孢粉素能有效地抵制外界干扰，而在其表面 缝隙中还覆盖着一层较厚的疏水性脂类和蛋白质物质，称之为含油层。此外，花粉表面还沉积着一层 由花药绒毡层分泌产生的花粉鞘物质（陈绍荣和杨弘远，2000） ，这种物质参与了花粉与雌蕊组织之间 “识别”或“拒绝”的过程。花粉壁的形成过程实质上是孢粉素和含油层的积累，在这个过程中需要 大量能产生脂肪类

15、物质的基因的控制，如拟南芥中 NEF1 基因对花粉壁发育过程中脂类物质的合成代 谢和孢粉素的积累起作用（Ariizumi et al, 2004） 。CER1 基因编码一种膜蛋白，同样影响花粉发育过程 中蜡质和含油层的合成（Aarts et al, 1995） 。FLOP1 是编码脂类转运蛋白的基因（Ariizumi et al, 2003） 。 1.1.1 花药绒毡层与花粉壁发育花药绒毡层与花粉壁发育 花粉壁不仅可以保护花粉内部营养成分免受外界环境侵害，而且还在花粉与柱头识别的过程中发 挥作用，如果没有发育完整的花粉壁，会导致植物雄性不育，所以，深入研究植物花粉壁的发育过程 及其调控机制显得

16、十分重要。花粉壁发育是一个重要而复杂的生物学过程，近年来，人们从细胞生物 1 文献综述文献综述 4 学、遗传学和分子生物学等方面对花粉及花粉壁发育进行了大量的研究，已经取得了不少进展。在此 基础上，对绒毡层与花粉发育之间的物质交流等问题仍然值得深入探究。绒毡层是所有陆生植物孢子 囊或花药的一种特化组织，与花粉壁的发育有着密切的关系。 1.1.1.1 绒毡层的类型绒毡层的类型 植物花药的绒毡层有变形型和分泌型两种类型。变形绒毡层中含有大量的脂体和少量电子密度很 小的造油体，几乎没有其他细胞器。相反，分泌绒毡层中却充满内质网，而且有许多质体和线粒体等 细胞器，脂体含量极少。前人研究表明，白头翁（母锡金等，1988） 、中国蓝果树（陈令静等，1991） 、 刺五加（刘林德等，1998） 、侧柏（曹玉芳等，2001） 、水稻（卢永根等，2002） 、防风（袁秋红等，2005） 的绒毡层属于分泌型，耳叶补血草、日本野木瓜的绒毡层是变形型。而有些物种不同的花粉的绒毡层 却又两种以上的类型，如牡丹