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1、厦门大学 硕士学位论文 环孢菌素A联合苦参碱逆转K562/ADM细胞多药耐药的研究及微流 控芯片检测药物外排的应用 姓名：陈怡 申请学位级别：硕士 专业：微生物 指导教师：彭兴跃 20090901 环孢菌素A 联合苦参碱逆转K 5 6 班D M 细胞多药耐药的研究及 微流控芯片检测药物外排的应用 硕士研究生：陈怡 指导教师：彭兴跃副教授 摘要 目的：本课题旨在研究环孢菌素A ( c s A ) 及苦参碱I M A T ) 单独及联合应用对人 慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K 5 6 2 及其耐阿霉素( A D M ) 细胞株 K 5 6 刁，A D M 糖蛋白( P g I y c o
2、p r o t e i n ，P g p ) 表达的影响，以探讨它们逆转多药耐药 ( M D R ) 的作用机理，为环孢菌素A 和苦参碱作为耐药逆转剂的临床应用提供理论 依据。并探讨微流控芯片在检测白血病耐药细胞株药物外排功能中的应用前景， 为临床逆转M D R 的药物筛选提供新的策略和方法。 方法：实验组分为下列几组：( 1 ) K 5 6 Z S 敏感细胞组：( 2 ) K 5 6 Z ，A D M 耐药细胞 组；( 3 ) K 5 6 刁，A D M + C s A 组；( 4 ) K 5 6 私D M + M A T 组；( 5 ) K 5 6 Z ，A D M + C s A + M
3、 A T 组。M T T 法测定逆转剂环孢菌素A 或和苦参碱的细胞毒性及药物作用后的逆转倍数，流 式细胞术测定细胞凋亡百分率的变化，以评价环孢菌素A 、苦参碱单独及联合与 阿霉素共同作用情况下对K 5 6 Z ，A D M 阿霉素耐药的逆转效果。荧光分光光度法、 流式细胞仪( F c M ) 检测细胞内药物( A D M ) 浓度的改变，微流控芯片检测白血病耐药 细胞株药物外排。免疫组化法检测M D R 1 基因编码的P _ g p 表达变化，流式细胞 术定量检测P g p 变化，以探讨环孢菌素A 及苦参碱逆转M D R 机制与P - g p 介导 的药物转运能力改变之间的关系。 结果：1 环
4、孢菌素A 和苦参碱对K 5 6 Z ，s 及K 5 6 刁，A D M 均有明显的抑制作用， 且I c 5 0 接近，无统计学差异【P 0 0 5 ) 。非细胞毒性剂量的两药联合应用后未出现 毒性叠加，以环孢菌素A 及苦参碱对K 5 6 狐D M 细胞的非细胞毒性剂量作为最佳 的逆转浓度；2 在与A D M 合用时，K 5 6 Z ，A D M + C S A 组及K 5 6 Z ，A D M + M A T 组的l c 5 0 均低于K 5 6 刁，A D M 耐药组l P 0 0 5 ) N o n c ，n o t o x i cd o s a g ea n dl o 、 ，- c ，汴
5、o t o x i cd o s a g e o fC s Aa n dM A Tw e r ed e t e r m i n e db yM T T a s s a y N o n c y t o t o x i cd o s a g ew a ss e l e c t e d a s 陀v e r s a Id o s a g e ；2 U s e da I o n gw i t hA D M ，I C 0 fb o t hK 5 6 2 ，A D Mw i t hC s Aa n d K 5 6 Z ，A D Mw i t hM A Tw e r eI o w e rt h a nt h
6、 a to fK 5 6 Z ，A D M ( P T M P ；V P ( 0 3 2 m g L ) + T M P T M P V P ( 0 3 2 m g L ) 证明了一 种经典的逆转剂( 如V P ) 加上一种副作用小的中药有效成分( T M P 等) 可降低毒副作 用，增强逆转效果。此外，任来成【47 J 等对异搏定、B s o 、三苯氧胺、c s A 的合并 应用研究表明，两种逆转剂合用效果好于单剂，不同机制的逆转剂合用好于单一 机制，组合后证明异搏定( P - g p 途径) + B s o ( 酶途径) 效果好于其他组合。 因此，在临床工作中，应充分考虑各种机制的影响，针
7、对侮例患者的具体情 况制定合理的治疗方案。同时采用多种逆转耐药手段，可能是逆转白血病M D R 的有效途径。 1 3 微流控芯片技术在生物学中的应用 微流控芯片技术是指采用微细加工技术，在一块几平方厘米的芯片上制作 出微通道网络结构和其他功能单元，把生物和化学等领域所涉及的样品制备、生 物与化学反应、分离和检测等基本操作单元集成或基本集成在尽可能小的操作 平台上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术。它 不仅使生物样品与试剂的消耗降至纳升( n I ) 甚至皮升( p I ) 级，而且使分析速度 大大提高，分析费用大大降低，从而为分析测试技术普及到户外、家庭开辟了一 条新
8、路。它充分体现了当今分析设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。现 已成为国内外生物化学、分析化学、分子毒理学、环境医学和预防医学等领域 l 前言 的研究热点。 1 3 1 微流控芯片技术的提出与发展 微流控芯片技术是在芯片毛细管电泳基础上发展起来的，1 9 9 2 年，M a n z 等【船】 采用微电子机械加工技术在平板玻璃上刻蚀微管道，研制出毛细管电泳微芯片分 析装置，成功地实现了荧光标记的氨基酸的分离，开创了微流控芯片技术之先河。 1 9 9 5 年，w o o e y 和M a t h i e s 【4 9 l 用自己研制的电泳芯片系统，成功地进行了D N A 测 序，在5 4s 内读
9、出了1 5 0 个碱基，准确率达到9 7 ，微流控芯片的商业开发价值 开始显现。1 9 9 6 年，w b o l l e y 等5 伽又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应( P c R ) 与毛细管电泳集成在一起，展示了微全分析系统在试样处理方面的潜力，从而为 微流控芯片在基因分析中的实际应用提供了重要基础。1 9 9 8 年，B u m s 等1 5 1 l 利用 光刻技术制作了1 个集n I 液体进样器、混合器、定位系统和可控温的反应室、电 泳分离系统和荧光检测器系统于一体的微流控芯片，用于D N A 分析。1 9 9 9 年s h i 纠5 2 1 研制出了9 6 根分离泳道的毛细管
10、阵列电泳芯片，9 6 根泳道呈辐条状分布在直 径为1 0 c m 的基片上，可在2 m i n 内同时分离9 6 个p B R 3 2 2 样品。2 0 0 0 年，A n d e r s o n 等【5 3 1 研制了一种可用于多样品的一系列复杂分子处理的高度集成的芯片，它能够 从m I 级水溶液样品中提取浓缩核酸，进行微晶化学扩增、酶反应、杂交、混合和 测定等，并可进行1 0 几种反应物的6 0 多个连续操作。 微流控芯片技术的实用与商业价值也为国内广大科技工作者所关注，浙江大 学方肇伦院士在微流控芯片试样引入与前处理技术、集成制造工艺和芯片分离理 论与应用方面做了大量工作，大连理工学院王
11、立鼎院士等在微光机电系统进行了 卓有成效的研究，其他科学家在微流控芯片在核酸、蛋白质分析与药物筛选方面 也取得了令人瞩目的成就，微流控芯片技术的研究与开发方兴未艾。 1 3 2 微流控芯片技术在生物分析中的应用 微流控芯片在微型化、集成化和便携化方面的巨大潜力，为其在生物医学、 环境监测和卫生防疫等众多领域的应用提供了广阔的应用前景。 1 3 2 1 核酵分析 核酸的扩增、分离及测序是微流控芯片的主要应用领域。K o p p 等【5 4 】提出了 连续流动式微流控P c R 扩增芯片，反应溶液循环流经不同的温区完成P c R 扩增反 应，整个扩增反应全部在流动中完成，展示了微全分析系统在试样处
12、理方面的潜 l 前言 力。K o u t n y 等【5 5 1 在刻有3 2 个通道的玻璃芯片上，四色测序8 0 0 b p ，仅用时7 8m i n 。 M e d i n t z 等【5 6 1 用9 6 通道圆盘式阵列芯片毛细管电泳进行D N A 测序，5 0 0 b p 分离测序 时间小于3 0 m i n ，总错检率小于1 。人们还利用微流控芯片技术开展了基因表达、 基因突变性、基因能和单核苷酸基因多态性等的研究，取得了丰硕成果。 1 3 2 2 肽和蛋白质分析 蛋白质的分离测定是生命科学中的一个重要部分，它可有效地帮助人们认识 蛋白质在生物功能中的作用，对寻找新的药物及新的诊断方
13、法有着不可估量的价 值。目前蛋白组分析主要是将蛋白质大分子降解为肽，再通过分析肽谱以及进行 肽链的测序加以实现。H o f m a n n 等5 7 1 利用等电聚焦毛细管电泳芯片技术，以c y 5 标记肽，对细胞色素c 、核糖核酸酶A 和肌红蛋白等9 种蛋白质混合物进行分离 检测，5 m i n 即完成了整个分析过程。G o t t s c h I c h 等【5 剐研究了微流控芯片蛋白质二 维电泳分离测定，以激光诱导荧光检测器检测，1 3m i n 内可对p 酪蛋白的胰蛋白 酶降解产物进行分离检测。 1 3 2 3 氨基酸分析 微流控芯片技术在氨基酸分析中的应用较为广泛。H e e r e
14、 n 等f 5 研设计了一种 循环柱切换的微流控芯片，微通道表面用线性聚丙烯酰胺衍生化，以F I T c 标记 氨基酸，取得了良好的分离测定效果。H u t t 等【删在硼硅玻璃电泳芯片上，以Y 环糊精作手性添加剂，对氨基酸样品进行了手性拆分分析。F a n g 纠6 1 1 对进样储 液池加以改进，制成连续换样流通式储液进样装置，实现了微流控芯片对氨基酸 的高通量分析。 1 3 2 4 细胞分析 微流控芯片通道宽度一般为1 0 5 0 U m ，和生物细胞大小相当，生物细胞在微 通道内非常容易操纵、观察和检测，因此，以微流控芯片进行单细胞研究具有独 特的优越性。Y a n g 等蚓在玻璃芯片
15、微通道中，用介电泳力和重力场流分级分离细 胞，垂直方向受到向下重力和向上介电泳力的作用而得到分离。S c h 川i n g 等【6 3 】以 化学消解法在线消解大肠杆菌细胞膜，胞内成分B 半乳糖苷酶释放出来，以荧光 法检测之。R o p e r 等【6 4 1 通过竞争反应对单个胰岛释放出的胰岛素进行了免疫分 析。随着微流控芯片技术的发展，尤其是检测灵敏度的日臻提高，微流控芯片对 单个细胞及胞内微量物质的分析与检测日益受到重视。 1 前言 1 3 2 s 药物分析与筛选 药物的分析与筛选是微流控芯片另一个可发挥重要作用的领域。c h i e m 和 H a r r i s o n 【6 5 】
16、利用免疫法测定了血清中治疗哮喘药物茶碱，他们将含有未标记的药 物样品和已知数量的荧光标记的药物及药物抗体混合，分离检测药物及药物与抗 体的复合物，分离分析时间仅4 0s 。K u b i n y i 【6 6 1 利用微流控芯片技术微型、集成化 的特点，把一些反应器及通道微型化、阵列化，同时实现了样品前处理和分离， 研制了一种动态的高通量药物筛选平台，在很短的时间内完成成千上万个药物和 生物靶标的作用鉴定，建立了一种基于分子水平的更适于药物筛选的技术体系。 1 3 2 6 免疫分析 蛋白质存在与否及浓度大小的特异性方法，因其具有高度的选择性，该法已 成为目前临床诊断、生物医学等的重要工具。c h e n g 等6 7 1 采用微流控芯片法进 行免疫分析，他们在微通道中集成微免疫反应器，免疫产物以电泳分离、荧光检 测，分别测定了卵白蛋白及抗雌二醇的含量。s a t o 等在微通道中构筑了一道围 堰，用来挡住结合抗体的聚苯乙烯微珠，血清中癌胚抗原和抗体结合，再以标记 了胶状金的
