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1、常用液相色谱柱使用与保养SOP,1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。,1.3.5.2正相色谱柱,1.3.5.3聚合物基质柱（eg.聚苯乙烯柱） 单独的聚苯乙烯类填料柱主要用于分离蛋白质类
2、等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若与离子交换基团共键则形成离子交换柱，用于分离酸性化合物（磺酸基团）、碱性合物（季铵基团）及药物代谢产物等。特点：在1PH13的流动相中稳定；分离峰形较好，柱子寿命较长。 1.3.5.4其他无机物填料柱 如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。,1.4液相色谱柱制备工艺简述 不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程（以硅胶柱为例）： 硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）Si-OH 基暴露（ 脱乙基，置换成H）海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）官能团键合（各种官能团与Si-OH 键合）端基封口（对残余的Si-OH 用小
3、分子的氯-甲基、氯-乙基键合 ）润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）高压平衡（轴向加压或径向加压，各厂家均有专利保护）干燥（此步为关键工艺步骤，各厂家均有专利保护）削平组件安装预平衡柱效测试流动相平衡柱效测试封口包装,1.5液相色谱柱分离机理概述,2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养 (1)认识色谱柱规范化使用与保养的必要性：延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本，逐步提高分析人员色谱柱使用与维护水平，确保试验数据的准确性、可靠性和重现性，提升个人在色谱领域的竞争力。 (2)熟悉几个概念： 液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相
4、，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。 运载溶剂（Shipping Solvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。 保存条件（Storage Conditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温
5、度。 保存溶剂（Storage Solvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与 比例的溶液。,(3)对新柱正确老化处理的必要性认识：新购色谱柱出厂前均采用适 合的运载溶剂（Shipping Solvent）饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。若老化方法不正确或时间不够，极易导致色谱柱在使用较短时间后即产生分离度下降、峰形变差、峰拖尾等柱效降低的情况。需根据色谱柱不同类型选择不同饱和与老化方法。 2.1普通C8及C18反相色谱柱（C8&C18 Reversed-phase chromatography column） （1）准备新鲜超纯水及色谱级乙
6、腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统管路干净。（新柱老化前，此步决不可忽略） （2）将色谱柱反向连接，不接检测器。用水-有机相（90：1095:5），以0.30.6ml/min流速冲洗2030min。（目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常） （3）再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水-有机相（90：1095:5），以0.30.6ml/min流速冲洗2030min。（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）,（4）连接检测器，开启柱温达3040，用水-有机相（90：1095:5），以0.30.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）
7、（5）用水-有机相（10：905:95），以0.30.6ml/min流速冲洗2h以上或在120min内以水-有机相（95:50:100）梯度变化，以0.30.6ml/min流速冲洗再用100%有机溶剂，以0.30.6ml/min流速冲洗1h以上最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内析
8、出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。,（7）然后更换成新制并经0.45um滤膜过滤，超声脱气后的流动 相，按检测方法平衡至少1h，待基线稳定后，开始进样检测。 （8）由于是新柱首次使用，在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是：用水-有机相（90：1095:5），以0.6ml/min流速冲洗1h以上再用水-有机相（90：1095:5），以1ml/min流速冲洗30min以上（或者采用溶剂梯度变化至100%有机相冲洗120min以上）最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。若流动相中有缓冲盐，建议用100%水冲洗1h以上后，再重复上述净化程序（但个别品牌C8
9、或C18色谱柱不耐受纯水冲洗者例外）。 在新色谱柱使用几次，均正常后，运行完毕净化处理程序可简化为：用水-有机相（90：1095:5），以1ml/min流速冲洗1h以上再用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗30min以上选择柱说明书中保存条件（Storage Conditions）规定的保存溶剂（Storage Solvent）冲洗10倍柱体积以上封口，保存。 （9）净化完毕，若次日不再使用，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。,（10）备注：老化用有机溶剂推荐使用色谱级甲醇，不同品牌色谱柱需区别对待；水需用去离子的超纯水。若色谱柱使用后入库保存，
10、长时间未使用，重新使用时仍需重新饱和。方法是：用水-有机相（90：1095:5），以0.6ml/min流速冲洗1h以上再用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗30min以上然后调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右最后用流动相平衡1h以上，进样检测。必需注意流动相pH值不能超过色谱柱pH耐受范围，过酸容易使键合相变态，过碱则易导致硅胶溶解柱床塌陷。 （11）特别提示：当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接接，不接检测器，用水-乙腈
11、（90：1095:5），以0.6ml/min流速冲洗2h以上再用100%乙腈，以0.6ml/min流速冲洗1h以上然后正向连接好色谱柱，用水-乙腈（90：1095:5），以1ml/min流速冲洗1h以上再用100%乙腈，以1ml/min流速冲洗1h以上，即可恢复。,（12）警告：无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间（30min以上）走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。使用与保存时，严禁用力甩，绝对杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。 2.2正相色谱柱（Norma
12、l Phase Chromatography column） 目前，正相色谱分析最常用的是氨基柱与氰基柱。 2.2.1氨基柱（-NH2） 氨基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。新购氨基柱老化处理及使用基本程序如下： 1）若需要在正相条件下使用： 用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲洗约50倍柱体积备注：氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，eg.正己烷-乙腈（99：1）。,再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲洗约10倍柱体积。 用正相流动相平衡1h以
13、上，确保柱压控制在6000Psi以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。 分析完毕，用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约30倍柱体积再用甲醇，以1ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积再用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约30倍柱体积，再按上述方法冲洗。 再用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂以1ml/min冲洗约10倍柱体积，保存即可，一般
14、用正己烷-乙腈（99：1）。 重新在正相条件下使用时，重复上述过程即可，时间可适当减少一半左右。,2）若需要在反相条件下使用： 先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲洗约30倍柱体积 再依次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿异丙醇甲醇甲醇-水（50：50）分别冲洗柱子约10倍柱体积再以0.5ml/min的流速，用pH11.0以下的氢氧化钠溶液冲洗柱子约30倍柱体积（注意：pH值切不可超过11.0）立即用水以0.5ml/min的流速冲洗柱子约30倍柱体积最后换成反相流动相平衡1h以上，待基线平稳，进样检测。（备注：若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在用反相流动相平衡之前
15、，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围及流动相中水的比例，pH值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。最理想的pH范围在pH 3.0-7.0，决不允许超过11.0。） 反相条件下使用完毕，净化处理程序同C18柱,但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于10%；净化完毕，先用甲醇以0.5ml/min的流速冲洗柱子约10倍柱体积然后用异丙醇以0.5ml/min的流速冲洗柱子约10倍柱体积最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂一般用正己烷-乙腈（99：1）以1ml/min冲洗约10倍柱体积密
16、封，保存即可。,2.2.2氰基柱（-CN） 氰基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。新购氰基柱老化处理及使用基本程序与氨基柱基本相同，主要程序如下： 1）若需要在正相条件下使用： 用异丙醇或正己烷以0.5ml/min的流速冲洗约30倍柱体积。（备注：氰基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，eg.正己烷或异丙醇。） 再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿、异丙醇或二氯甲烷以相同的流速冲洗约10倍柱体积。 用正相流动相平衡1h以上，确保柱压控制在6000Psi以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。,分析完毕，用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱
