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1、主讲：彭立华 组员：彭立华 2016212803 刘占洋 2016201804,iTRAQ及SILAC技术,iTRAQ技术简介,iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同位素相对标记和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。 iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的
2、相同肽段表现为一个峰； 在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。,实验流程图,iTRAQ试剂标记原理,iTRAQ试剂包括3部分： 报告部分 平衡部位 肽反应部分,报告部分共有8种：质量数分别为114121，因此iTRAQ最多可同时标记8组样品。 肽反应部分：能将报告部分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。 平衡部分：质量数分别为3124，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同
3、一肽段具有相同的质荷比。,（2）对一级质谱的每个峰进行二级质谱图（MS/MS）图中黄色峰为报告集团峰。,（3）下图为上图的黄色部分报告基团的峰的放大图（横坐标的数量级小，所以显示出多个单峰）,主要步骤,1. 不同的蛋白质样品首先分别进行蛋白酶水解 。 2. 采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合。 3. 使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱。 4. 8个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰。 5. 对加入标记的肽段进行二级质谱，这时，平衡基团从报告基团上脱落。 6. 二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号： 113、114、115、116、117、
4、118、119和121，其强度分别代表8个标记的样品的同一个肽段。 7. 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值. 8.对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。,iTRAQ技术优势,分离能力强，分析范围广； 定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息； MS具备高灵敏度，检测限低； 分析时间快，分离效果好； 自动化程度高，用于离体检测； ITRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白，核蛋白，胞外蛋白。ITRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或弹雨200KD的蛋白。,SILAC技术简介,细胞培养条件下稳定同位素标记技术(S
5、table isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，利用含轻、中或重型同位素标记的必需氨基酸（主要是Lys和Arg）培养基培养细胞，来标记细胞内新合成的蛋白质，一般培养5-6代，细胞中的蛋白质将都被同位素标记。不同处理的蛋白样品等量混合，经SDS-PAGE分离，切胶，酶消化，LC-MS/MS分析即可得到有关蛋白的定量及定性结果。 SILAC不仅可以对蛋白质进行定性分析，还可以通过质谱图上一轻一重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平，实现对蛋白质的精确定量。 SILAC在比较蛋白质组学，蛋白与蛋白互作，蛋
6、白与DNA互作，蛋白与RNA互作等研究领域均有广泛应用。,实验流程图,主要步骤,1.细胞培养和蛋白质提取。制作培养基，接种，培养至5-6个细胞世代，裂解并提取蛋白。 2.同位素标记样本与非标记样本按照1:1混合。 3.SDS-PAGE分离和染色。 4.胶内酶解，肽段提取。 5.LC-LTC-FT(液相色谱接线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT） 6.数量和质量分析，对得出的数据与数据库中数据进行对比。,SILAC技术优势,1、高通量，可同时标记细胞内的蛋白，与质谱联用可同时分析鉴定多种蛋白； 2、同位素标记效率高、稳定，不受裂解液影响，结果重复性好，可信度高； 3、灵敏度高，
7、实验所需蛋白量明显减少； 4、体内标记，结果更接近真实生理状态。,iTRAQ与SILAC技术的比较,1，SILAC定量主要是一级质谱定量，iTRAQ主要是二级质谱定量 2，SILAC是体内标记，需要在进行材料培养的时候就加入标记，主要使用在动物或植物细胞培养的过程中，针对其它类型的组织等样品就不适用，但是iTRAQ是体外标记，是将蛋白提取后再进行标记，可以适用于几乎所有材料样品。 3，两者的定量准确性及蛋白分辨率方面应该差别不是很大。 4，由于SILAC需要进行培养的过程中添加标记，所以需要比较长的时间才能比较彻底地标记，所以时间短用iTRAQ,时间长用SILAC（相对昂贵）。,谢 谢 大 家！,
