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1、酶联免疫吸附实验 ELISA 操作规则（新手适用）一、实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。二、实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物
2、酶，碱性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)25，式中1指HRP百分浓度为100ml含酶蛋
3、白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（einheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 （二）酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色49
4、2*四甲替联苯胺黄色460*氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252，2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405，420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360，450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420* 终止剂为2mol/L H2SO4* 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应： HRP+H2O2复合物 复合物+AH2过氧化物酶+H2O+A AH2 为无色底物，
5、供氢体； A 为有色产物。（三）ELISA常用的四种方法1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；加底物。底物的降解量抗原量。 2间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体， 形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。 测定底物的降解量抗体量。3双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加底物。底物的降解量抗原量。4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;(1) 加入酶标抗原；(2)，(3)加入酶标抗原和待
6、测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。 三、仪器和材料1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板， 40， 96孔)。2. 酶联免疫检测仪3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG， 工作稀释度1:1000。4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4，保存，Na2CO3 0.15克， NaHCO3 0.293克，蒸馏水稀释至100 ml。5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20， ，保存. NaCl 8g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4.12H2O 2.9g， Tween20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。6. 洗涤液：同稀释液
7、7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml)， 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml， 蒸馏水12.5ml， 邻苯二胺10mg， 溶解后， 临用前加30%H2O2 40 微升。9. 终止液：2mol/LH2SO4。 四、操作步骤1.包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释， 一般为110微克/孔，每孔加200微升，37温育1小时后，4冰箱放置1618小时。2.洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。3
8、.加封闭液200微升，37放置一小时。4.洗涤同2。5.加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。同时作稀释液对照。37放置2小时。6.洗涤同2。7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG， 每孔200微升， 放置37 1小时。8.洗涤同2。9.加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10-15分钟。10.加终止液：每孔50微升。11.观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤新手适用一、流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于
9、一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN-COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D公司最新产品为FACS V
10、antage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是临床型;EPICSALTRA和FACSVantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。二、流式细胞仪主要技术指标 1.流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子，两个细胞间的荧光差5%即可区分。3.前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映
11、被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。4.流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5.流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。三、流式细胞仪主要构造和工作原理-流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统。流动室（FlowCell或FlowChamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通
12、过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60m、100m、150m、250m等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。图12.1流动室示意图(采自CoulterTrainingGuide)四、流式细胞仪
13、主要构造和工作原理-激光光源及光束形成系统 流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488m，此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633m）和/或紫外激光管。流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22m66m)，在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。五、流式细
14、胞仪主要构造和工作原理-光学系统 流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片（LP）-只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片(BP)-只允
15、许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT)，如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525，接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575，接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。六、流式细胞仪主要构造和工作原理信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号，散射光分为前向角散射（ForwardScatter，FS）和侧向角散射或900散射（SideScatter，SS），散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种，一种是细胞自发荧光它一般很微弱，一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强，这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出
