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1、第二章 免疫组织化学 的基本理论与技术,一、免疫组织化学的基本理论 原理： 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC) 是利 用抗原与抗体特异性结合的原理，使用荧光素、酶、金 属离子、同位素等标记抗体以确定组织细胞内抗原(多肽 和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。,此法可在光、电镜水平观察细胞膜及胞内某种抗原 物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白 质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及 代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的 原位分析细胞组成物质的手段。,二、抗原与抗体,1.抗原 (antigen,Ag) 定义：是指能刺激机体产生免
2、疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。 蛋白质：免疫原性最强； 多糖：免疫原性次之； 脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。,2.抗体 (Antibody, Ab) 定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出 一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清内。 分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根据制备方法不同分为两种:单克隆和多克隆,IgG的结构,IgG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段
3、或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。,多克隆抗体,制备原理： 将纯化的抗原注射入动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。,单克隆抗体,Ag,合成抗体,效应性B 细胞 (浆细胞),不能在体外生长,瑞士Kohler,英国Milstein,多发性骨 髓瘤细胞,多发性骨 髓瘤细胞,不能合成抗体,能在体外大量繁殖,脾,多发性骨 髓瘤细胞,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,抗体,单克隆抗体,多克隆抗体,缺点:价格较高，
4、容易出现假阴性反应。,实质:是受同一种抗原刺激，由多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。,优点:容易制备，价格便宜。,缺点:可能与多种特异性和非特异性的抗原决定簇反应，出现非特异性染色，影响结果的判定。,实质:是受同一种抗原刺激，由单个B淋 巴细胞克隆所分泌的抗体。,优点:特异性强，敏感性高，抗体产量高。,首选,三、免疫组织化学的基本技术,免疫组织化学技术是用标记物标记的抗 原(或抗体)检测组织和细胞内的抗体(或抗 原)，从而达到诊断或研究的目的。,三、免疫组织化学的基本技术,特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准 确与细胞和组织标本制备质量好坏密切相关。 因此，组织和细胞标本的取材和制备至关
5、重 要。,（一）标本制备,1.组织标本制备： 石蜡标本 冰冻标本 振动标本 塑料包埋切片标本,2.细胞标本制备： 印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 体外培养细胞 离心涂片机法,石蜡标本制备 取材,石蜡标本制备 取材 （1）取材时间：迅速，一般在2h以内进行。 （2）取材刀：锋利，避免来回拖。 （3）组织块大小：厚薄要均匀，厚度0.2cm，大小1.5X2.0 cm2为宜。较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、 大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性 肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应略取薄一 些。,石蜡标本制备 取材 （4）取材部位：取含待检抗原部位，还应取
6、病灶与正常交界 处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织 作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开 坏死区。 （5）淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围脂肪组织。 （6） 如组织内有缝线、钉书针或骨组织，必须除去或避开， 如碰到不可避免的骨组织或钙化组织，应与技术室讲明，进 行脱钙处理。,石蜡标本制备 取材 （7）纤维组织、肌肉组织取材时，注意纤维或肌肉走向，尽 可能选择与纤维或肌肉的走向平行、并以此为长轴切取。,石蜡标本制备 固定 （1）定义：组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量 接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。 （2）目的：防止组织细胞自溶与腐败，防止
7、细胞内的酶对蛋 白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水 化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时 相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧 性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。,石蜡标本制备 固定 （3）原则：最好地保存细胞和组织的形态结构和最大限度地 保存抗原的免疫活性。 （4）注意事项： 组织一旦离体必需及时固定。 固定液的量应为组织的4-10倍以上。 固定液的种类、浓度、固定温度和时间要适当。,石蜡标本制备 固定,（5）方法： 物理固定： 如血涂片可采用空气快速干燥、冻结干燥等， 组织也可于液氮中固定。,石蜡标本制备 固定, 化学固定： 浸
8、入法 灌注法 微波固定法等,石蜡标本制备 固定,浸入法：组织立即浸于固定液内,时间在212h之间。,石蜡标本制备 固定,灌注法（全身/局部）：插管由左心室插入主动脉,先用PBS冲洗血液,再以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min内取材,再置同一固定液内浸入固定l3h。可使固定液到达全身各处组织。,石蜡标本制备 固定,微波固定： 微波处理后,温度升高,分子运动加快,促进固定液向组 织内渗透,短时间达到固定效果。,石蜡标本制备 固定,（6）固定液的种类： 醛类固定剂：为双功能交联剂, 可使组织间相互交联，将抗原保存于原位。 特点是对组织的穿透性强，收缩性小。是常用固定剂。 非醛类固定剂：为非醛类双
9、功能试剂，单独应用时，边缘固定效应较重，但 与戊二醛或多聚甲醛混合使用时，效果明显好转。较适用于多肽类激素的组织 固定。 丙酮及醇类固定剂：其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，能够较 好地保存抗原的免疫活性。但醇类对低分子蛋白、多肽及胞浆蛋白质的保存效 果较差。与冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明显改善。,醛类固定剂: 10中性缓冲福尔马林：该固定剂易使组织硬化而致浸蜡困难，因此固定时间不宜过长。 4多聚甲醛磷酸缓冲液：适应性较广泛，因较温和，适于组织标本的较长时期的保存。 Bouins液：对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适和免疫组化染色，较常用，通常4下固定68h。 Zam
10、boni液：用于光、电镜免疫细胞化学观察。, 非醛类固定剂： 碳化二亚胺液: 适用于含多肽激素组织的固定。 碳二亚酰胺一戊二醛液(ECDG液)：对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是培养细胞电镜免疫细胞化学的良好固定剂，也常用于多肽类激素固定。 Zenkers液：因含重金属，固定时间要短，以24h为宜。染色前必须脱汞。, 丙酮及醇类固定剂： 丙酮：常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。保存抗原性较好，穿透性及脱水性较强。 95%乙醇：用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。效果较差,和其他试剂混合使用,染色较好。 AAF液：较常用的固定液。(95100乙醇85ml，冰醋酸5ml，浓
11、甲醛10m1)。 Carnoy液：100乙醇醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4保存备用。,4固定剂的选择 固定剂的种类很多，至今尚无统一标准的固定剂，10中性甲醛是国际最通用的固定剂。需指出，同一固定液固定的组织，染色结果可截然不同；不同的抗原和不同的组织标本往往需反复试验，必要时可做多种固定液对比，才能选出最佳的固定液。,石蜡标本制备 脱水和透明 （1）脱水 定义：利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。 重要性：脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度（原因是组织在纯酒精内时间过久，发生组织质地发生变化）容易造成组织发脆。 常
12、用试剂：梯度酒精（低深度至高浓度）、丙酮,石蜡标本制备 脱水和透明 （2）透明 定义：为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。 常用试剂：二甲苯、香柏油 注意：脱水剂透明剂要定期更换。,石蜡标本制备 浸蜡和包埋 （1）浸蜡 定义：组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程。 用其他浸透剂（如火棉胶、明胶等）渗入组织内部的过程 可称为浸透或透入。,石蜡标本制备 浸蜡和包埋 （1）浸蜡 注意事项： 浸蜡温度过高，在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二 甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破 坏；浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防
13、附在组织上， 造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。,石蜡标本制备 浸蜡和包埋 （2）包埋 定义：用包埋剂来支持组织的过程称包埋。 包埋的关键一是平整，二是方位。 通常采用组织的最大面包埋。 囊壁、管腔组织应竖直包埋。 小块多颗组织，应尽量放在一起，修去余蜡。 去除缝线。 胃黏膜活检标本采取窄面竖起包埋。,石蜡标本制备 切片 用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均， 机器磨损；过慢会使切片增厚。 切片厚度一般为35微米。 切片的要求是完整、薄、均匀。 切下的片膜其大小形状应与组织块一致，以免误诊、漏诊。,石蜡标本制备 切片 问题的原因及可能处理的方法： 组织发脆：一般是
14、脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织 本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。 切片卷起：刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角过大，切片太厚等。 蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关 厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴 太向前，或切片机已磨损。,石蜡标本制备 切片 切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨 片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。 切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组 织脱水不佳。,石蜡标本制备 展片、捞片、烤片
15、 展片：水温应在42至45之间，这主要和包埋蜡的熔点 有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺 无法摊平。,石蜡标本制备 展片、捞片、烤片 切片有皱摺对策： 可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到 热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点； 在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动 把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄（脂肪除外）。,石蜡标本制备 展片、捞片、烤片 捞片： 玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下 1/3的中间。 烤片： 一般在60的温箱内烤片0.51小时左右，温度过
16、高，会引起切片细 胞收缩；时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。,冰冻标本制备 优点： 能较好地保持抗原和酶的活性。 冰冻切片简便快速。 适用范围： 新鲜的组织及已固定的组织均可。 缺点： 不能用于回顾性研究。 不利于常规检查和长期保存标本。 不如石蜡切片结构清晰。,冰冻标本制备 取材： 同石蜡标本。 固定： 目的：保持结构完整，防冰晶产生。 方法： 干冰-丙酮法： 液氮法 蔗糖法,冰冻标本制备 固定： 干冰-丙酮法：将150200ml丙酮装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和，不再冒泡时，温度可达-70，之后将含有组织块的小盒轻轻放到干冰制冷后的丙酮液面上(注意不要使丙酮进入包埋液中)，待数十秒后组织冻结即可置恒冷箱内以备切片，或置-80低温冰箱内贮存。 液氮法：将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入
