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1、 柳志杰 等/基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用 Chinese Journal of Biotechnology May 25, 2012, 28(5): 565576 http:/ 2012 Chin J Biotech, All rights reserved Received: September 16, 2011; Accepted: November 28, 2011 Supported by: Shanghai Pujiang Program (No. 08PJ14038), National Special Fund for State Ke
2、y Laboratory of Bioreactor Engineering (No. 2060204), SRF for ROCS, SEM, Shanghai Leading Academic Discipline Project (No. B505). Corresponding author: Qiang Hua. Tel/Fax: +86-21-64250972; E-mail: 上海市浦江人才计划 (No. 08PJ14038)，国家重点实验室专项经费 (No. 2060204)，教育部留学回国人员科研启动基金，上海市重点学科建设项目 (No. B505) 资助。 565生物工程
3、学报 sv)s y0eT 柳志杰，周利，花强 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237 柳志杰, 周利, 花强. 基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用. 生物工程学报, 2012, 28(5): 565576. Liu ZJ, Zhou L, Hua Q. Metabolic regulation of isocitrate lyase regulator in Escherichia coli based on metabolic flux information. Chin J Biotech, 2012, 28(5): 565576
4、. 摘 要: 基因的表达受不同的转录调节因子调节。大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子 (IclR) 能够抑制编码乙醛酸支路酶的 aceBAK 操纵子的表达。本研究基于代谢物的13C 同位体物质分布来定量解析代谢反应，主要研究了 iclR 基因在大肠杆菌生理和代谢中的作用。大肠杆菌 iclR 基因缺失突变株的生长速率、糖耗速率和乙酸的产量相对于原始菌株都有所降低，但菌体得率略有增加。通过代谢途径的流量比率分析发现基因缺失株的乙醛酸支路得到了激活， 33的异柠檬酸流经了乙醛酸支路；戊糖磷酸途径的流量变小，使得 CO2的生成量减少。同时，乙醛酸支路激活，但草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不变，
5、说明磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环没有激活，没有过多的碳原子在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反应中以 CO2形式排出，从而确保了菌体得率。葡萄糖利用速率的降低、乙酰辅酶 A 的代谢效率提高等使得 iclR 基因敲除菌的乙酸分泌较原始菌株有所降低。 关键词: 代谢流量分析，代谢流比率，异柠檬酸裂解酶调节因子，大肠杆菌 工业生物技术ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech May 25, 2012 Vol.28 No.5 http:/ 566 Metabolic regulation of isocitrate lyase regulator in Escher
6、ichia coli based on metabolic flux information Zhijie Liu, Li Zhou, and Qiang Hua State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China Abstract: Gene expression is regulated by different transcriptional regulators. The transcriptiona
7、l regulator isocitrate lyase regulator (IclR) of Escherichia coli represses the expression of the aceBAK operon that codes for the glyoxylate pathway enzymes. In this study, physiological and metabolic responses of the deletion of the iclR gene in E. coli BW25113 were investigated based on the quant
8、ification and analysis of intracellular metabolic fluxes. The knockout of the iclR gene resulted in a decrease in the growth rate, glucose uptake rate and the acetate secretion rate, but a slight increase in biomass yield. The latter could be attributed to the lowered metabolic fluxes through severa
9、l CO2generating pathways, including the redirection of 33% of isocitrate directly to succinate and malate without CO2production as well as the reduced flux through the pentose phosphate pathway. Furthermore, although the glyoxylate shunt was activated in the iclR mutant, the flux through phosphoenol
10、pyruvate (PEP) carboxykinase kept almost unchanged, implying an inactive PEP-glyoxylate cycle and no extra loss of carbon atoms in the mutant strain. Both the reduced glucose uptake rate and the active glyoxylate shunt were responsible for the minor decrease in acetate secretion in the iclR knockout
11、 strain compared to that in the wild-type E. coli strain. Keywords: metabolic flux analysis, metabolic ratio, isocitrate lyase regulator, Escherichia coli 基因的表达是通过不同的转录调节因子来调控的，转录调节因子是一类能结合在DNA特定序列上的蛋白。转录调节因子结合在DNA特定序列上就能促进或者抑制RNA聚合酶 (RNAP) 的结合能力。RNA聚合酶 (RNAP) 亲和力的降低一般会降低基因的表达，而RNAP亲和力的提高一般会加强基因的表达。
12、大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子 (IclR) 能够抑制aceBAK操纵子的表达，aceBAK操纵子编码乙醛酸支路的3个酶：异柠檬酸裂解酶 (由aceA基因编码)、苹果酸合酶 (由aceB基因编码) 和异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 激酶/磷酸酶 (由aceK基因编码)。乙醛酸支路使得大肠杆菌能够在乙酸或脂肪酸上生长。乙醛酸支路是大肠杆菌在这些碳源 (乙酸、脂肪酸) 上生长时的必需途径，因为它避免了碳原子通过三羧酸循环而以两分子CO2的形式失去。乙醛酸支路激活时，异柠檬酸在异柠檬酸裂解酶催化下裂解形成乙醛酸和琥珀酸，琥珀酸可以重新进入三羧酸循环，乙醛酸和乙酰辅酶A在苹果酸合酶的催化下形成苹果酸1
13、。乙醛酸支路的第3个酶异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 激酶/磷酸酶具有双重功能，它通过磷酸化和去磷酸化异柠檬酸脱氢酶作用来控制异柠檬酸的流向2。 从上世纪90年代，代谢工程作为一门新的学科被提出以来3，代谢工程已经成当前国际生物技术领域的一个新的研究前沿。代谢流量分析作为代谢工程的一个主要的分析工具3-4，其结果是细胞内整个中心代谢途径的代谢速率，也即为流量。代谢流量分析可以用来阐明细胞的代谢网络和调控机制、提高生物生产过程的产量、注释未知的基因、分析药物的毒性等5-8。近年来，基于稳定同位素13C标记碳源的代谢流量分析方柳志杰 等/基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调
14、控作用 567法已经成功地被应用于分析多种微生物，如大肠杆菌9-12、集胞藻13、酵母菌14和琥珀酸放线杆菌15-16等。 13C代谢流量分析实验流程为：在培养基中添加稳定同位素13C标记的底物，如首位13C标记的葡萄糖 (1-13C-glucose) 或均匀13C标记的葡萄糖 (U-13C-glucose) 等，当细胞代谢这些13C标记的底物时，底物上的同位素标记信息会随代谢反应从不同方向传递到代谢网络的各个中间代谢物上，进而传递到蛋白氨基酸上。菌体蛋白氨基酸含量丰富，提取方便，且这些氨基酸是由一些关键的中间代谢物合成的，根据它们的同位体分布信息可以推导得到中间代谢物的同位体分布信息17，
15、并借助代谢流比率方法来进行代谢流量的定量解析18。 当前，对细胞的中心代谢途径基因的代谢调控研究得比较多，但对转录调节因子的代谢调控机理研究得则相对较少。本文主要应用13C代谢流量分析来研究iclR基因敲除对大肠杆菌BW25113生理和代谢的影响，进而揭示转录调节因子异柠檬酸裂解酶调节因子在细胞代谢调控中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 E. coli BW25113、E. coli BW25113 iclR，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保藏。iclR基因敲除的大肠杆菌菌株E. coli BW25113 iclR是在原始菌E. coli BW25113染色体上敲除了iclR基因。 1.1.2 主要试剂及仪器 均匀13C标记的葡萄糖 (U-13C-glucose，pu99)、首位13C标记的葡萄糖 (1-13C-glucose，p199)、N,N-二甲基甲酰胺和衍生剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺均购自Sigma公司。其他试剂均为分析纯。高效液相色谱 (HPLC) 为Agilent 1200型液相。气相色谱质谱联用仪 (GC-MS)为Agilent 6890GC-5975MS型气质联用仪。酶标仪为BioTek Power Wave XS2型酶标仪。 1.1.3 培养基 培养基为M9合成培养基，其组成为：葡萄糖3 g/
