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1、中国科学技术大学 高分子科学与工程系 王延梅 E-mail:wangyanm Tel. 0551-63607652,聚合物在生物高分子分离中的应用,分离过程及原理 聚合物在DNA分离中的应用 聚合物在蛋白质分离中的应用,内容,1. 分离过程及原理,定义：将一定样品中相关的化学物质拆解成纯的物质称为分离。 方法：萃取、过滤、离心、色谱、电泳等。 实质：混合的逆过程。混合是自发的，分离是被动的，需要能量或外力的推动。 原理：差速运动过程，即利用速度差别进行物质的分离与纯化，,电泳：带电粒子在电场作用下于一定介质（溶剂）中所发生的运动。 电泳分离及其条件选择的依据：离子所带电荷越多、解离度越大、体积
2、越小、溶液的黏度越小，电泳速度越快。 电渗：毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动，起因于定域电荷。 定域电荷：牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。 电渗的方向：与固体表面电荷所具有的电泳方向相反； 电渗的强度: 与定域离子的数量或固液界面成正比；与流路通道孔径有关。,熔融硅毛细管中的电渗,定域电荷,产生指向负极的电渗,CE工作原理,例：当把样品从正极端注入到石英毛细管中时，不同符号的离子将按表中的速度向负极迁移。,电渗率：,电迁移率：,2聚合物在DNA分离中的应用,人类基因组计划（Human Genome ProjectHGP） 1986年，著名生物学家、诺贝尔
3、奖获得者H. Dulbecco提出人类基因组计划。1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。,遗传学,核酸(DNA和RNA)的功能：储存和传递信息，指导和控制蛋白质的合成。 DNA:主要的遗传物质，通过复制而将信息由亲代传给子代。 RNA:与遗传信息在子代的表达有关。,刑侦学,腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C),DNA的组成,DNA的结构,毛细管电泳分离DNA的过程,电渗是CE的基本现象之一，它可以控制
4、组分的迁移速度和方向，进 而影响CE的分离效率和重现性,DNA的分离理论,310型全自动遗传分析仪,ABI Prism 3100遗传分析仪,DNA分析仪,ABI 310-DNA中的染料,如何控制电渗流？,理论： 能影响电渗的因素都有可能用于电渗的控制 实际： 能理想地调节电渗而又不影响分离过程的控制方法目前 不多见对于DNA分离及测序来说，pH-8.3，常用管壁涂层 （涂覆)技术.,用于DNA分离的聚合物,交联聚合物,非交联聚合物,筛分介质：凝胶和非凝胶(非交联的聚合物溶液) 。 要求：低黏度、高的筛分能力和自涂覆功能。 非凝胶：均聚物、共聚物（包括无规、嵌段、接枝等）、共混物等。,均聚物,线
5、形聚丙烯酰胺,聚N, N-二甲基丙烯酰胺,聚氧化乙烯,羟乙基纤维素,聚乙烯基吡咯烷酮,存在的问题：,共聚物,a. 无规共聚物 poly (DEA-co-DMA) 聚 (N, N -二乙基丙烯酰胺- co -N, N - 二甲基丙烯酰胺） poly (AM-co-DMA) 聚(丙烯酰胺- co - N, N - 二甲基丙烯酰胺) poly (AA-co-AG) 聚(丙烯酰胺- co - -吡喃型葡萄糖) poly(AM-co-AAG) 聚(丙烯酰胺- co -葡糖酰丙胺) poly(NEEA-co-NMEA) 聚(乙氧基乙基丙烯酰胺- co -乙氧基甲基丙烯酰胺)等 b.嵌段共聚物 PEG-(C
6、nF2n+1)2 末端带有碳氟化合物的聚乙二醇PEO-PPO-PEO 低分子量的聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物 BEB/EBE 聚环氧乙烷和聚环氧丁烷的三嵌段共聚物等 C. 接枝共聚物 PAM-g-PNIPAM （聚丙烯酰胺-g- 聚N-异丙基丙烯酰胺) PNIPAM-g-PEO (聚N-异丙基丙烯酰胺-g- 聚环氧乙烷) PAM-g-PDMA （聚丙烯酰胺 -g- 聚N，N- 二甲基丙烯酰胺） PDMA-g-PMMA（聚N，N- 二甲基丙烯酰胺-g-聚甲基丙烯酸甲酯）等 存在的问题：,共混聚合物,不同分子量的PEO分离ds 和ss DNA HEC，LPA等不同分子量的混合物也都能成功地
7、对DNA分离或排序 存在的问题： 线形聚丙烯酰胺（ LPA，高分子量)： 优点：测序功能优异，如DNA读取长度 缺点：高黏度、无自涂覆能力 聚N, N-二甲基丙烯酰胺（PDMA): 优点：优异的自涂覆功能、低黏度 缺点：测序功能不如LPA 很少有均聚物能同时满足以上要求。,准互穿网络聚合物 (quasi-IPN),(1) PVP和PDMA组成的quasi-IPN分离双链DNA(ds-DNA),4%PVP均聚物+4%PDMA均聚物,Quasi-IPN(4%PVP+4%PDMA),PVP、PDMA、它们的共混物、quasi-IPN 形成网络的原理,Quasi-IPN重现性的研究,Electroph
8、oresis 2002, 23, 1460-1466,(2) PAM和PDMA组成的quasi-IPN在DNA测序中的应用,反相微乳液聚合合成PAM,Electrophoresis 2005, 26, 126-136,PAM/PDMA组成的quasi-IPN用于DNA测序,不足之处：,(3) quasi-IPN/GNPs 复合介质,TEM images of (A) GNPs20 (20 nm), (B) GNPs40 (40 nm), and (C) GNPs60 (60 nm) in water, and (D) GNPs40 (40 nm) in quasi-IPN3 polymer s
9、olution.,The partial four-color (base C, T, A, G) electropherograms of standard DNA sample using 2.5% w/v quasi-IPN3/GNPs40-1 by CE at 50.,Electrophoresis, 2007, 28, 1072-1080. Electrophoresis, 2007, 28, 2998-3007 中国发明专利：ZL 2006 10114099.3.,(4) quasi-IPN/官能化金纳米粒子复合介质,The schematic representation of
10、reaction routes for (A) GNP-PDMA and (B) quasi-IPN/GNP-PDMA.,(A1) GNPs (18 nm) ; (A2) GNP-PDMA; (B1) fresh GNP solution; (B2) GNP solution after 2 months, (B3) GNP-PDMA solution after 10 months.,Electrophoresis, 2008, 29,4637-4645,(5) quasi-IPN/官能化的多壁碳纳米管双网络复合介质,小结,将GNPs加入到由较低分子量的LPA和PDMA组成的quasi-IP
11、N中， 形成了quasi-IPN/GNPs。quasi-IPN/GNPs的测序时间不仅小于quasi-IPN，而且分离度也高于quasi-IPN，接近甚至高于含较高分子量LPA但不含GNPs的quasi-IPN。 将GNP-PDMA加入到由较低分子量LPA和PDMA所组成的quasi-IPN中得到quasi-IPN/GNP-PDMA.。GNP-PDMA的存在可以改善GNPs与整个测序体系的相容性、增大网络的缠结程度并增加GNPs在体系中的含量，从而导致整个筛分网络更加受限和稳固、介质的表观分子量更高并且孔径更小，因此与之前的quasi-IPN/GNPs相比，quasi-IPN/GNP-PDMA
12、可以进一步增强ssDNA的测序性能。 通过原子转移自由基聚合法（ATRP）制备了PDMA官能化的多壁碳纳米管（MWNT-PDMA）添加剂，并加入到由LPA（3.3 MDa）和PDMA所组成的quasi-IPN中而得到了聚合物/纳米管双网络复合筛分介质（quasi-IPN/MWNT-PDMA）。柔性的quasi-IPN聚合物网络和刚性的MWNTs（具有独特的管状结构）网络相互作用，从而避免聚合物之间彼此滑移、稳固和制约总的筛分网络、增加介质的表观分子量并减小介质的孔径。因此，quasi-IPN/MWNT-PDMA介质中的这种更受限、更稳固且孔径更小的纳米结构使得测序性能更优良。,聚合物在蛋白质分
13、离中的应用,后基因组时代（Post-Genome Era) 科学的发展以及技术上的突破，使人类基因组计划一再提前，生命科学已经进入了后基因组时代，科学家们的研究重心已从揭示基因组DNA的序列转移到在整体水平上对基因组功能的研究。后基因组时代的一个重要标志就是蛋白质组学（Proteomics)的建立。在蛋白质组学中，蛋白质分离分析的重要性及意义也日见突出。 2001，人类蛋白质组计划(Human Proteome Project, HPP),蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，两性，存在等电点，因其空间结构的复杂性，有亲水或疏水之分。蛋白质是基因表达的最终产物，是细胞结构的组成成分，生命
14、现象中绝大多数生物功能是通过蛋白质来实现的 。,蝴蝶从卵变虫变蛹再变蝶，是个绝对神奇的过程。,基因只是遗传信息的载体，要研究生命现象，诠释生命活动的规律， 只了解基因组的结构是远远不够的，必须对基因的编码产物-蛋白质 进行系统深入的研究。,Human Brain Project,蛋白质和疾病,阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）与tau蛋白： 在AD患者脑内，发病机制很多，其中一种观点认为因Tau蛋白异常过度磷酸化，并聚集成双螺旋丝形式，与微管蛋白的结合力降低，失去了促进微管形成和维持微管稳定的作用。异常磷酸化Tau蛋白的病理性沉积，导致了神经原纤维缠结（NFTs）的形成。
15、,蛋白质在低于等电点时会带上正电荷，在高于等电点时带负电荷 若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点，蛋白质则吸附H 而带正电荷，由于 静电相互作用，蛋白质与管壁发生吸附。,碱性蛋白质（pI8）所带电荷量随pH的变化曲线；,在pH4时，碱性蛋白质（pI8）与 毛细管壁发生吸附,P/ACE MDQ (Beckman Coulter Instruments),pH3, SiOHSiO _。,蛋白质吸附,Dolnik, V., Hutterer, K. M., Electrophoresis 2001, 22, 4163-4178. Towns, J. K., Regnier, F. E., Analyt
16、ical Chemistry 1992, 64, 2473-2478. Hjerten, S., Kubo, K., Electrophoresis 1993, 14, 390-395.,极端pH值法,pH高于蛋白质的pI时，毛细管内壁对蛋白质产生静电排斥抑制吸附，但是，蛋白质存在的自然状态为pH410，高pH如11.0时，容易使蛋白质变性或者水解。 pH小于1.5（熔融硅或石英的等电点）时，蛋白质的质子化导致其质荷比差别较小，分辨率难以提高。 对等电点相近的蛋白质不易实现分离。 一般认为，使蛋白质混合物分离的首选pH值应和蛋白质混合物的pKa值基本一致。,McManigill D. Anal Chem,1986，58：166170.,添加小分子添加剂,表面活性剂：季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂。 中性盐：如磷酸盐，硫酸钾等。 胺类：三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺，N, N, N, N-四甲基-1, 3 -丁二胺（TMBD）等。 有机溶剂：醇类、乙腈、
