药剂学第四章-复制

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1、1,第四章 病毒的复制,生命科学与技术学院 李 灏 lihaoh,2,第一节 用于病毒复制研究的实验系统 第二节 病毒的复制周期 第三节 病毒的异常复制,3,一、病毒培养基 二、噬菌体细菌培养系统 三、动物病毒动物细胞培养系统 四、植物病毒植物原生质体培养系统,第一节 用于病毒复制研究的实验系统,4,一、病毒培养基 由于病毒的专性寄生的习性，所以其培养也较为困难，理想的病毒培养基应满足3个条件： A. 须提供活的相应敏感宿主细胞； B. 这个宿主细胞能提供病毒附着的受体； C. 宿主细胞不对侵入的病毒核酸进行破坏（没有破坏特异性病毒核酸的限制性核酸内切酶）。,5,二、噬菌体细胞培养系统,1、噬

2、菌体的培养特征 在液体培养基内：原先浑浊的菌液变成透明的裂解溶液。 在固体培养基上：宿主细菌菌落上出现空斑（噬菌斑）。,6,2、噬菌体增殖规律的描述方法,离 心 术,抗病毒血清,培养,定时取样测噬菌斑数,以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为 纵坐标，绘出的曲线为一步生长曲线。,7,将低剂量的噬菌体悬液加入敏感细菌的培养液中，使得一个病毒与10-100个细菌细胞相混合。 经过短时间的培养使噬菌体吸附在细菌上，再用抗体或稀释去掉未吸附上的噬菌体。 用新鲜培养液把经过上述处理的细菌悬液高倍稀释。 培养后定时取样，将含有噬菌体的样品与敏感细菌培养物混合培养，计算每个样品在培养基平板表面产生的噬菌斑数目。

3、以培养时间为横坐标，噬菌斑数为纵坐标，可以绘出一步生长曲线。,8,3、一步生长（One-step growth）,成熟的噬菌体颗粒，除M13等少数噬菌体外，均借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可见的培养物溶解。噬菌体的这种生长（繁殖）方式称为一步生长（One-step growth）。 以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标，绘出的曲线为一步生长曲线。,9,潜伏期（latent phase)eclipse phase + intracellular accumulation phase)从噬菌体吸附菌细胞至菌细胞释出新噬菌体的最短时间。 裂解 期（rise phasse)宿主裂解，噬

4、菌体数不断增加的时期。 平稳期(plateau phase)宿主全部裂解，噬菌体达最高点后的时期。 裂解量(Burst phase)每个被感染细菌释放新的噬菌体的平均数。,裂解量(Burst phase) = -,进行一步生长曲线的测定，能了解噬菌体在菌体内的最短潜伏期，和平均收获量，还可测知理化因素的变化对噬菌体感染循环的时间和对被感染菌释放噬菌体的影响。,平稳期噬菌斑数,潜伏期平均噬菌斑数,10,效价(滴度Title)-是微生物或其产物、抗原与抗体等活性 高低的标志。 噬菌体效价-指噬菌体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每毫升中含有

5、的噬菌斑形成单位（plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效价。,4、噬菌体效价,11,5、噬菌体效价的测定,1）斑点试验法 2）液体稀释管法 3）双层平板法 4）单层平板法 5）快速玻片法,12,培养,涂布菌液, ,不同稀释度点样, ,噬菌斑,1）斑点试验法,13,培养液和宿主细胞,计数管中完整宿主细胞数 （定时取样对活细胞计数）,噬菌体数=原细胞数 活细胞数,2）液体稀释管法,14,计数噬菌斑,噬菌斑数=试样中噬菌体数,3）双层平板法,15,试样+宿主细胞 +琼脂培养基,低倍镜下计数噬菌斑,4）快速玻片法,16,6、噬菌体-细菌培养系统的优点,敏感的宿主菌易于在琼

6、脂平板上培养，数目易于控制； 噬菌体在细菌内增殖往往导致细菌培养物变得清亮，在合适的接种密度下，很容易在琼脂平板上形成噬菌斑，结果容易观察； 噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内，可反复多次实验。,17,动物病毒培养的主要方法有 动物接种 鸡胚接种 组织培养 其中组织培养技术已被广泛应用,三、动物病毒动物细胞培养系统,18,起初的动植物病毒复制研究是建立在活的宿主体系之上的 20世纪初鸡胚开始用于病毒的研究 1943，我国学者黄祯祥就开始利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和实验 1948-1955年，动物病毒的研究从利用实验动物整体过渡到利用组织培养。小鼠、昆虫、鱼

7、、猪、狗以及各种灵长类包括人的Hela细胞系的体外培养相继建立,19,1949年John Enders等在原代人体细胞中繁殖出脊髓灰质炎病毒 组织培养技术促进了病毒疫苗的研究 1952年，R. Dulbecco利用组织培养技术发展出空斑定量病毒的方法，首次测定脊髓灰质炎病毒和西方马脑炎病毒的侵染性颗粒。,20,1、不同的病毒，易感动物不同，常用动物有：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴等； 2、接种的途径也有多种，可：皮下、皮内、脑内、腹腔、静脉等接种； 3、病毒动物动物出现感染症状，据症状鉴定病毒或取病变组织进一步检查。,（一）动物接种,21,活的宿主体系：植物、动物,起初的病毒学研究是建立在活的宿主

8、体系之上的。 动物宿主体系主要应用在生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。 植物宿主体系目前应用仍较广泛,22,1、接种途径有：尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、绒毛尿囊膜 2、培养数天后，观察鸡胚情况或取培养物进一步鉴定,尿囊腔接种,羊膜腔接种,尿 囊 腔,羊 膜 腔,（二）鸡胚培养,23,卵黄囊接种,绒毛尿囊膜接种,卵黄囊,绒毛尿囊膜,24,组织或细胞培养是指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。 原代细胞 传代细胞 二倍体细胞,（三）组织培养,25,1、细胞种类 （1）原代细胞： 以无菌手续采动物等的组织切碎洗净后用胰蛋 白酶消化

9、得分散的单个细胞，加培养液在细胞瓶内 培养所获得的单层贴壁细胞为原代细胞； 原代细胞消化、重新分装并培养所得细胞为次 代细胞。 特点：对病毒易感性高，主要作为自标本中分 离的工具。,26,（3）二倍体细胞： 在体外分裂50-100代后仍保持其二倍染色体数目的单型细胞，常用人胚肺二倍体成纤维细胞。,（2）传代细胞系： 能在体外持续增殖传代的细胞系，多由癌细胞或二倍体细胞突变而成。,27,常用的细胞培养,28,2、动物病毒在细胞内增殖的检查与鉴定,（1）观察细胞变化(cytopathic effect,CPE)： CPE病毒感染细胞后引起的细胞病变。,正常成纤维细胞,单纯疱疹病毒感染 后细胞变圆等

10、,呼吸道合胞病毒感染 后形成多核巨细胞,29,（2）病毒的定量测定： TCID50（50% tissue culture infective dose）： 将病毒进行系列稀释后行细胞培养，观察能使半数细胞培养孔或试管内的细胞发生细胞病变（CPE）时的病毒量，即TCID50。 蚀斑实验 病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶，称 蚀斑，蚀斑是由一个感染性病毒体复制形成的， 称蚀斑形成单位，病毒悬液中的感染性病毒量 以每毫升的蚀斑形成单位PFU来表示。,腺病毒空斑,30,病毒感染细胞后形成嗜酸性或嗜碱性包涵体,狂犬病毒感染后在脑细胞的胞浆内出现嗜酸性圆形或椭圆形的包涵体，可供辅助诊断.,31,3、组

11、织培养优点,（1）便于纯化病毒； （2）可直接观察细胞变化（包括细胞出现病 变或转化）； （3）可对病毒的复制进行基础性研究； （4）可进行空斑纯化病毒克隆； （5）可滴定病毒含量。,32,开辟了定量动物病毒学的新领域以及研究病毒的复制及其与寄主相互关系的新技术。 动物细胞组织培养技术的开发使脊髓灰质炎病毒的疫苗能在体外培养的猴肾细胞中培养并大规模生产。 利用组培技术能较方便地诱导减毒弱株系，开发新疫苗。,4、动物细胞组织培养技术发展的意义,33,活的宿主体系 植物原生质体培养体系,四、植物病毒植物原生质体培养系统,34,35,病毒侵入宿主细胞，指令宿主细胞的代谢反应和利用其资源，合 成病毒的

12、核酸与蛋白质，然后再装配成大量的子代新病毒以一定 的方式释放到细胞外，再感染其它细胞。这种繁殖方式与一般微 生物不同，通常称为“复制”或“增殖”。在复制过程中，病毒 通常破坏宿主细胞和引起病毒病。 一、吸附 二、侵入 三、脱壳 四、病毒大分子的合成 五、病毒的装配与释放,第二节 病毒的复制周期,36,HIV复制周期,37,病毒复制的条件 活细胞-严格寄生性 敏感细胞-选择性（亲嗜性） 病毒增殖的方式：自我复制,38,吸附是指病毒以其特殊结构（吸附位点）与宿主细胞表面的特异受体（受体位点）发生特异性结合的过程。如噬菌体是以其尾丝尖端的蛋白质吸附在菌体表面的特异受体上的。,吸附具有高度专一性，即只

13、有当吸附位点与受体位点为合适的匹配，吸附才能够发生。,一、吸附（Adsorption）,39,病毒颗粒与宿主细胞的最初结合是可逆的。静电吸附，受环境pH影响。 病毒表面蛋白与宿主细胞表面受体分子由于结构互补，形成不可逆的结合。 接触可逆结合特异性吸附（病毒配体位点与细胞膜特异受体结合，不可逆）,40,裸露病毒,包膜病毒,41,病毒能否呈不可逆吸附，主要由以下条件决定： 病毒吸附蛋白。病毒表面蛋白质（衣壳蛋白或包膜蛋白）的性质决定了病毒与敏感的宿主细胞表面受体分子的特异性结合。这些能够识别细胞表面受体的病毒表面结构蛋白能吸附于细胞受体，这样的病毒表面结构蛋白称为病毒吸附蛋白（virus atta

14、chment protein, VAP）。 细胞表面受体分子。是指存在于宿主细胞表面（细胞膜或细胞壁）上能被病毒吸附蛋白识别，使病毒特异性地进入细胞，启动感染发生的特殊细胞位点。病毒的细胞受体分子在很大程度上决定了病毒的宿主范围、组织亲和性，并影响病毒的致病性。 环境因素。温度、离子环境、pH值。,42,T偶数噬菌体吸附,43,HIV吸附,44,病毒颗粒或其一部分（核酸）进入宿主细胞的过程称侵入。 各类病毒侵入的方式有很大的区别。,二、侵入（Penetration）,45,（一）噬菌体的注射侵入（Injection）,注射方式：吸附后，尾丝收缩，使尾管触及细胞 壁，尾管所含酶类物质可使细胞壁产

15、生一些小孔， 然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细 胞内，蛋白质外壳留在细胞外。 噬菌体侵入与脱壳是同步完成的， 壳体留在细胞外，仅有病毒核酸 或者少量蛋白质（如A蛋白）和 其他物质进入宿主细胞。,46,（一）噬菌体的注射侵入（Injection）,47,动物病毒多数通过吞噬作用整个进入宿主细胞，包膜病毒也可通过膜融合使核衣壳进入宿主细胞，裸露的二十面体病毒可直接穿入。 细胞的内吞作用。又称为病毒胞饮（Viropexis）。病毒被细胞吞入，病毒颗粒在吞噬泡内，由于吞噬泡与溶酶体的结合，病毒被释放出来。 病毒颗粒包膜与细胞质膜的融合。 完整病毒颗粒穿过细胞膜的移位方式。,（二）动物病毒的

16、侵入,48,1、内吞作用,裸露病毒,包膜病毒,49,流感病毒的侵入,50,2、融合,51,HIV侵入,52,3、病毒核酸直接进入,53,植物病毒一般无主动侵入宿主细胞的能力，往往借宿主细胞受外力损伤而侵入。 介体感染。靠昆虫的刺吸式口器将病毒离子注入植物体内。 非介体感染。通过伤口进入 再通过胞间连丝或输导组织迅速向其它部位扩散引起普遍感染；带毒植株的嫁接。 植物病毒侵入宿主细胞后才能发生脱壳。,（三）植物病毒的侵入,54,病毒侵入细胞后，病毒的包膜和衣壳被除去而病毒核酸释放出来的过程称为脱壳。 病毒在细胞内必须脱去衣壳，其核酸方可在宿主细胞中发挥指令作用。,三、脱壳(Uncoating),55,脱壳后，病毒核酸进入宿主细胞，一方面抑制宿主细胞的正常生长，一方面利用宿主细胞内的原料与合成系统开始一系列生物合成反应，复制出子代病毒核酸，合成病毒