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1、生物芯片分类及其应用,主讲人：邵自星,目录,一、生物芯片的分类 1、基因芯片 2、蛋白质芯片 3、芯片实验室 二、生物芯片的应用 1 、基因表达分析 2 、基因型、基因突变和多态性分析 3 、疾病的诊断与治疗 4 、药物研究中的应用,一、生物芯片的分类,生物芯片概念：是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物分子进行准确、快速、高通量筛选。 生物芯片分为三大类：基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室，最近又出现了细胞芯片、组织芯片、糖芯片以及其他。,基因芯片,基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，是生物芯片技术中发展最成熟以及最先进入应用
2、和实现商品化的技术。,基因芯片的原理,在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。,蛋白质芯片,定义：高密度的蛋白质阵列，是蛋白质阵列的发展。在几平方厘米的面积中可以包含几万个不同的蛋白质点，可用于大规模的分析。,蛋白质芯片原理,蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能
3、与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持 。,芯片实验室,芯片实验室（Lab-on-a-chip）或称微全分析系统（Micro Total Analysis System， or microTAS）是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分
4、析的一种技术 。,二、生物芯片的应用,生物芯片技术的出现和飞速发展引起国际上的广泛关注和重视。自从美国宣布正式启动生物芯片技术，随着世界各国也开始重视并加大对生物芯片的投入，以生物芯片为核心的相关生物技术产业正在全球崛起。 以下主要讲述一下生物芯片在基因表达分析， 基因型、基因突变和多态性分析， 疾病的诊断与治疗， 药物研究中的应用。,基因表达分析,1、 分析基因表达时空特征 美国Stanford大学的V.R.Iyer等人，对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。首先，他们用成纤维细胞中的8600个基因片断制成基因芯片的探针阵列，通过与mRNA反转录形成的cDNA的杂交反应，可
5、以判断出该基因的活性。 在试验中，成纤维细胞被置于无营养的环境中，使绝大部分基因的活性关闭，两天后，加入10%的血清，24小时内，分6个不同的时间点，观察基因的活化情况。,试验结果表明，在所有被监测的基因中，约有500个基因最为活跃，而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中，有28个基因共同作用，控制细胞的增殖；8个与免疫反应的激活有关；19个与血管重建有关；另有许多基因，与血管新生密切相关。 通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征。,基因表达分析,2 、基因差异表达检测 对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相
6、互关系，细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。 目前差异研究方法主要有表达序列标签（ESTs）测序、差减克隆（subtractive cloning ）、差异显示（differential display）、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。 cDNA微阵列杂交可监测大量mRNA的转录，快速地检测出极其微量的mRNA，同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段之一。,基因表达分析,美国Stanford大学的David Botstein利用cDNA微阵列芯片，对乳腺癌细胞的基
7、因表达进行了分析，发现其基因表达水平明显低于正常细胞。 利用基因芯片对表达进行分析，在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。 通过这种实验方法，可以建立一种全新的肿瘤分类学方法，即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。,基因表达分析,3 、发现新基因 定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。 如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎（RA）和炎症性肠病（IBD）的基因表达研究中，由RA或IBD组织制备探针，用Cy3和Cy5荧光素标记，然后与靶cDNA微阵列杂交，可检测出炎
8、症疾病诱导的基因如TNF-、IL或粒细胞集落刺激因子，同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。,基因表达分析,在缺乏任何序列信息的条件下，微阵列可用于基因发现和基因表达检测。 目前，大量人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400,000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。,基因表达分析,4 、大规模DNA测序 芯片技术中杂交测序（sequencing by hybridization, SBH）技术及邻堆杂交（contiguous stacking hybr
9、idization, CSH）技术即是一种新的高效快速测序方法。 用含65 536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200 bp长DNA序列， 采用67 108 864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。,基因表达分析,SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。 CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。 计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于13聚寡核苷酸
10、微阵列的作用，可测定数千个核苷酸长的DNA序列。,基因表达分析,基因型、基因突变和多态性分析,在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。 通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但是，由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，因此分析起来就十分困难，然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题，利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。,人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势
11、是不言而喻的，就临床一种新的、强有力的分子工具。 基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。,疾病的诊断与治疗,1 、遗传病相关基因的定位 我国有4 000万育龄妇女，每年有2 000万新生儿，准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。 DNA芯片技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析将越来越重要。 HGP使许多遗传疾病基因得以定位，配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次筛查多种遗传病，既经济快速又敏感可靠。,疾病的诊断与治疗,2 、肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原
12、癌基因和抑癌基因的发现和定位。 在艾滋病的治疗中，使用HIV蛋白酶抑制剂是一种重要的手段。然而，病毒对该药物的反应却有着很大的差异。利用基因芯片技术，研究人员分析了取自102个病人的167个病毒单体，发现这些同为美国HIV-I B亚种的病毒的基因序列存在极大差异，其中蛋白酶的基因片断差异最大，在编码99个氨基酸的序列中，竟有47.5%存在明显突变。这些氨基酸的突变，直接导致了病毒抗药性的不同。,疾病的诊断与治疗,人类恶性肿瘤中，约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关，目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区（外显子2外显子11）错意突变和单碱基缺失突变的基因芯片。以外显子7的第
13、248个密码子为例，野生型为CGG，在芯片上做出5条探针，相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G-C，根据杂交后的荧光显色图，就可以分析出该位点为何种突变。,疾病的诊断与治疗,3 、感染性疾病的诊断 HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异，这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性，因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。,疾病的诊断与治疗,Hayward以3 648个插入片段建立猎枪微阵列(shotgun microarray)，通过差异杂交和DNA测序找到了疟原虫无性和有性生殖阶段基因差异表达，为抗疟药设计提
14、供了线索。 可以预测在不久的将来，人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因，实现真正意义上的“组合检测（profile tests）”。,疾病的诊断与治疗,从经济效益来说，最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。 对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。采用所谓“译码器”策略（Decoder strategy）来确定药物靶标。从而找到“导向药物”。
15、基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物。细菌或肿瘤组织的耐药性也涉及基因改变可以用DNA芯片鉴定。,药物研究中的应用,1、 新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。 噬菌体展示技术可创造大量蛋白质，目前多用于抗体库的建立和筛选，进而可用于受体-配体相互作用的研究。 基因组学、蛋白质组学和生物信息学（bioinformatics）将大大促进制药工业的发展。,药物研究中的应用,第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗，获得美国FDA的批准。 除肿瘤外，用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。 同时，有时一
16、种药物的作用是多方面的，基因芯片有助于发现一种药物的新的功能。原先设想的作用是针对某一靶标的，但在全基因或广范围筛选中却发现该药在另一方面有很强的抑制作用，从而开发成另一种新药。,药物研究中的应用,2 、调查药物处理细胞后基因的表达情况 Clarke等用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况，发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。 该研究提示，这类研究既有助于阐明药物的作用机制，也有助于确定药物作用的靶基因，为新药研究提供线索。,药物研究中的应用,3、 对药物进行毒性评价 应用芯片查找药物的毒性或副作用，进行毒理学研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表达的改变。 如果药物能抑制重要基因的表达，则对它的深入研究就值得考虑。 用芯片作大规模的表达研究往往可省略大量的动物试验。 若某个正在筛选的潜在药物作用靶细胞得到的基因表达图谱与已知的具有毒性副作用的药物得到的基因表达图谱相似时，就要考虑是否停止药物开发（drug development）中花费巨大的临床实验阶段。,药物研究中的应用,Nuwaysir等研制了包
