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1、细胞工程 黑龙江大学生命科学学院 孙晓丹,第一章 细胞培养的设施与基本条件 1.1 动物细胞工程实验室的设置 1. 无菌操作室 2. 培养与观察室 3. 制备室 4. 储藏室 5. 清洗与灭菌室,1、无菌实验室 无菌实验室或操作室的设计原则是，有防止微生物污染和有害因素的影响措施，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。 无菌实验室最好能单独设置。如果条件有限，只能限制在一个大实验室内，应划分不同的功能区或用铝合金隔板隔开，将无菌操作室与清洗、消毒灭菌区、制备、储藏和孵育区分开。,根据体外培养细胞生长特点和条件，拥有一个无菌实验室、一台超净工作台和一个恒温培养箱是细胞培养的三大必备设施。,更
2、衣间放在外，主要供更换衣帽、鞋子等。缓冲间位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。 操作间放在内间，主要供无菌操作和细胞培养，房间应不受日光直射，大小适当，高度适宜(2.5m)。房间过大，清扫和消毒不便；过小，操作不便；顶部过高会影响紫外线的有效灭菌效果。,无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域。亦可把净化工作台置于操作室中，这样更为安全。 此室最好能与外界隔离，不能穿行或受其他因素干扰。操作室的大小依需要而定，一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。,如果条件有限，仅做一般要求的细胞培养，在相对狭小的空间内，只设置净化台而不设操作室。 但要注意季节气候环境的影响和注意无菌操作
3、环节。 做要求较高的细胞培养，最好设置无菌操作室，有条件的应设净化工作室，以避免季节影响和杜绝污染。,墙壁应光滑无死角，以便清洗和消毒。工作台不应紧靠墙壁放置，台面漆成白色或灰色，以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 若能购置超净工作台则更好。 无菌操作间应为密闭式，设置空气消毒用的紫外线灯、空气过滤净化器和恒温装置。,目前大多数从事细胞培养工作的实验室都已装备了超净工作台。这种工作台占据空间小，安装方便，操作简单，投资少，效果不比无菌操作室差，即使不设置单独的无菌实验室，只要购置安装了超净工作台，也能进行简单的细胞培养工作。,2、超净工作台,它们的基本工作原理大同小异：内设鼓风机，驱动空气通
4、过高效滤器过滤净化后，让净化空气徐徐通过台面空间，使操作区构成无菌环境。,超净工作台种类繁多，但主要有三大类：一类是侧流式； 第二类为直流式； 第三类为外流式，或称为水平层流式。,这三类工作台各有利弊。 侧流式和直流式能形成气流屏而保持操作台无菌，但在净化气流和外界气体交界处可因气流的流动形成负压，使少许未净化气体混入，有可能发生污染，尤其在多雨季节的南方，会增加污染机会。,它们的区别在于气流的方向不同，侧流式即净化后气流由左侧或右侧通过台面流向对侧；直流式为气流从上向下或从下向上流动；外流式为气流向操作者方向吹来。,现在很多实验室普遍使用的侧流式工作台,是一种封闭式的工作台,两个侧面各留两个
5、圆洞，供操作者手臂伸入进行操作，污染机会极少。但要拿取较大物品或进行较大范围的操作就不够方便。,外流式工作台因气流面向操作者流动，外方气流不易混入，但在做有害实验时，对操作者健康不利。使用此类工作台一般可用有机玻璃将上半部遮挡，让气流从下方通过，以尽量减少其不利影响。,（2）久未使用的工作台在使用前应进行彻底清洗、消毒灭菌。用1:1000的来苏儿或75%的酒精擦洗台面，滤器械的灰尘可用真空吸尘器清除。停止使用时最好用作防尘布或塑料布套好，避免灰尘积聚。,超净工作台作为一种设备也需要维护和保养，才能延长其使用寿命。一般应注意以下几点： （1）超净工作台一般宜安装在避免日光直射、清洁无尘的房间内。
6、若能放在无菌操作区内则更佳，不仅效果好，而且滤器（料）的使用寿命长。,（4）不设在无菌操作区内经常使用的净化台，要注意过滤器的效果。一般2-3年更换一次，3-6个月拆下清洗一次，以保持过滤器的净化效果。,（3）净化工作台内不应放置其他与细胞培养无关的用品，更不能用作储存室。每次使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机，然后进行培养操作。,用于细胞培养的培养箱分变通电热恒温培养箱和CO2培养箱。温控变化一般不超过0.5,最适温度为37。因此要求培养箱具有较高的灵敏度。 控温装置的优劣是电热恒温箱质量的关键，选购时一定要注意。一般选购隔水式或晶体管式控温培养箱，适用于封闭式的培养。,3、恒
7、温培养箱,另外，要维持箱内温度、湿度的恒定，可用无菌蒸馏水定期注入外箱内，或用无菌潮湿的纱布置于托盘内，然后将培养皿、培养板置于上面，再放入CO2培养箱，以保持湿度，避免培养液蒸发而影响细胞生长。,CO2培养箱在细胞培养实验室已得到普通的使用。它能提供较为恒定的CO2，通常为5%，使培养液的pH保持稳定，适用于开放式或半开放式的培养。需要注意的是：为了避免污染，要对培养箱定期进行消毒，如有紫外灯则用紫外线消毒，如无紫外灯须用酒精定期擦试消毒。,进行细胞培养除了上述三大设备外，还需配备电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜和倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、消毒器、抽滤装置等。,4、其他
8、设备,冰箱：一般用双门冰箱，既有4左右的冷藏区，又有-20以下的冷冻区。如条件许可，应有一台普通冷藏冰箱和一台低温冰箱（-70）。前者主要用于储存培养液、生理盐水、Hanks液、试剂等培养用的物品和短期保存的组织标本。后者用于保存需较长时间存放的制剂，如酶、血清和组织标本等。冰箱应保持清洁，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易挥发物品。,1.电热干燥箱：主要用于烘干热消毒玻璃器皿，也可用于干热消毒。在用于干热消毒时，温度一般要求达到160(灭菌)或180(去除热原)，消毒时间须在2h以上。细胞培养实验室常用的干燥箱为鼓风式电热干燥箱（规格为5605 mm500 mm500mm），虽然升温较慢，但温
9、度均匀，效果较好。鼓风与升温同时开始，待温度达100后再打开，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂损坏。金属解剖器械、塑料制品、橡胶制品等不能放在干燥箱内灭菌。,2.水纯化装置： 这也是细胞培养不可缺少的设备。因为体外培养细胞对水的要求较高，无论是细胞培养液还是配试剂等都应使用两次以上蒸馏的双蒸水。离子交换装置处理的水因为不能完全去除有机物而极少应用。外售蒸馏水常用金属器蒸馏，易混入金属离子，须用玻璃蒸馏器重新蒸馏一次后才能使用。目前国内普通使用的是自动双重纯水蒸馏器(碳管加热)，较为安全、方便、蒸馏速度也较快，但不宜直接用自来水蒸馏。配制培养液的水应用配液前蒸馏的新鲜三蒸水。,显微镜： 应有一台普通
10、显微镜和一台倒置显微镜。前者用于细胞计数和一般观察，后者用于观察细胞的生长情况和有无污染。若条件许可，应配置照相系统和荧光显微镜。,离心机： 一般应配有普通离心机，最好应配置高速冷冻离心机。普通离心机转速在4000r/min以下，台式的就可满足要求。用于制备细胞悬液、漂洗、分离细胞。若开展细胞脱核、DNA和RNA抽提、组织匀浆等研究，需使用高速、大容量和能进行调温的离心机。,3.细胞冷冻贮存器： 主要是液氮容器。国产的能满足要求。容积大小根据实验室需求选购。一般小实验室用35L3的，大实验室，多可购50 L的。窄颈瓶维持液氮时间长（1月左右），但存取不方便。宽颈瓶存取方便，但维持液氮时间短（7
11、-10天）。定期加液氮的时间可据此来确定。由于液氮温度达-196，使用时要防止冻伤手。,4. 抽滤装置：有Zeiss滤器、玻璃滤器和金属滤器。滤器中的滤膜一般用0.20.3m孔径的微孔滤膜。 凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化用胰酶等都须用滤器过滤除菌。,5.清毒器： 一般常用小型手提式高压蒸气消毒器。 它可用于无法干热高温烘烤消毒的各种塑料培养用品、橡胶制品等的消毒。,体外培养细胞使用的器材品种较多。 由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。,第2章 清洗与消毒 第1节 器材准备,常用的玻璃器材有各种
12、规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。 无论是初次使用还是培养后重复使用的玻璃器材均需要进行消毒处理。首次使用的玻璃器材应先用自来水初步刷洗，然后用稀盐酸溶液（1%）浸泡过夜，再用自来水冲洗，最后处理方法与重复使用的器皿的处理。,1、玻璃器材,（2）清洁液处理。 将刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重铬钾清洁液中。该清洁液具有高度腐蚀性，操作时必须穿长筒胶靴，戴防酸橡皮手套，围裙和眼镜，以防清洁液溅出而灼伤。在配液时还需注意将酸缓慢放入水中，以防酸遇水放热产生酸溅出或使玻璃及陶制容器裂开而使清洁液外泄。切勿将水加入酸中，以防酸溅出。常用清洁液为75%和50%两种。,重复使用的玻璃器皿的处理
13、步骤： （1）刷洗。 用软毛刷和优质中性洗涤剂刷洗，去除器皿内外表面的杂质。刷洗时注意不要用力过重，以防损坏器皿内表面光洁度，影响细胞生长；也不能留有死角。 器皿数量大时，可使用超声波清洁装置，冲洗干净后晾干。,一般用121磅高压蒸气灭菌20分钟。玻璃滤器使用后及时用自来水冲洗滤器表面的剩余物，然后用单蒸水浸泡，除去滤板内堵塞杂物，若用滤膜则将滤膜丢弃，加4N盐酸浸泡12小时以上，用自来水冲洗，再用单蒸水抽滤2次，双蒸水(或去离子水)抽滤冲洗、包装、121高压蒸气灭菌20分钟。也可用5%洁消精浸泡20分钟后，再按上述方法冲洗和灭菌。,将玻璃器皿放入时最好装入塑料网袋内，再浸入清洁液中，玻璃瓶内
14、不要残留气泡。一般浸泡12-24小时后取出。在清洁液中取出的器皿先用自来水冲洗10次以上，再用单蒸水冲洗三次以上，最后用双蒸水（或去离子水）冲洗1-2次，晾干，包装杀菌。,体外培养细胞中塑料器皿的使用越来越多，有进口的，也有国产的。主要有多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴。 多孔培养板有4孔、6孔、24孔、96孔等规格可供选择。多数为进口产品，已消毒灭菌密封包装，使用时只需打开即可。,2、塑料器材,消毒采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕，以免影响细胞的贴附性。 所以，培养要求较高的细胞的塑料器材，最好一次性使用。,有一次性使用的，也有反复使用的。在我国不少实验室，由于经费有限
15、，经过清洗和消毒灭菌再使用的较多。 塑料器皿若使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，或先用2%NaOH处理之后再用3%HCl浸泡30分钟，最后用自来水冲洗干净，并用双蒸水冲洗3次以上，晾干。,已用过的橡皮制品，先用自来水冲洗干净，然后用洗衣粉加热煮沸10分钟后，用自来水边冲边用力搅动，以充分洗净残余洗衣粉，然后用蒸馏水煮沸2次，每次15分钟，再用单蒸水冲洗2次，必要时还要用双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或放于铝盒内，用121高压蒸气灭菌20分钟。,3、橡皮器材 应选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的
16、塞子、盖子。新购置的橡皮制品，用自来水冲洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氢氧化钠煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，再用4%盐酸煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，单蒸水冲洗3次，双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或置于铝盒内，用121高压蒸气灭菌20分钟。,已用过的金属器材，及时用酒精棉球擦干净，包装入铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。,4、金属器材 细胞培养中需用多种金属器材，用于解剖、取材、剪切组织及持取物件等，常用的有剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等。新的金属器材，先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。,5、其他物品 纱布先用自来水洗净后，再用单蒸水冲洗，然后用单蒸水煮沸2次，每次15分钟，并经常用长镊子翻动，再用单蒸水洗2次，晾干后折成八层包装，用121高压蒸气灭菌20分钟。,用于细胞培养过程中的各种人工合成培养液、缓冲液和酶滤液等也需要进行除(灭)菌处理。缓冲液常用高压蒸气消毒。血清用56水浴灭
