色谱分析法总论

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1、第六章 色谱分析法导论,Chromatography,1、色谱法的产生 色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3 有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响,一、色谱分析法简介,6-1 概述,（1）一种是CaCO3 吸附，使色素在柱中停滞下来 （2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,Tsweet的实验,(1）粗叶绿素+石油醚

2、 （2） 石油醚 流动相 相对运动 固定相（吸附剂）CaCO3 胡萝卜素 利用不同物质 叶黄素 在流动相与固定相 叶绿素 作用时的行为差 异得到分离(吸附) （3）小刀割开，用醇溶出 （吸附作用）,1931年 库恩 奥地利化学家 胡萝卜素植物色素分离 20世纪30年代 离子交换色谱建立 1940年 吸附色谱与电泳相结合 1941年 分配色谱创立 1952年 气相色谱法建立 1968年 高效液相色谱法建立 1975年之后 离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离,Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化

3、学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱,色谱法中共使用两相 固定相固定不动的相 CaCO3 流动相推动混合物流动的液体 石油醚 色谱法：混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。 流动相,液体 流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC发展，高压液相色谱。,气体 1952年产生气相色谱，是色谱法一项革命性进展。,固定相： （1）固体吸附剂：CaCO3、Al 2O3等 （2）液体固定相（载体+固定液高沸点有机化合物，涂在载体上） 色谱分离法一定是先分离。后分析 一定具有两相；固定相和流动相 分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离,随着被分离

4、样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,我国情况,我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。,4、特点： （1）分离效能高 （2）灵敏度高 （3）分析速度快 （4）应用范围广,二、色谱分析法分类,1、按两相状态分类 气相色谱气体作流动相 （1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。 （2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。,液相色谱液体作流动相 （1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作

5、固体相。 （2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。,2、按操作形式分类 （1）柱色谱： 填充柱色谱固定相填充到柱管内 毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上， 中间是空的。 （2）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。,二、色谱分析法分类,0.25mm 厚 纤维素，硅胶 玻板,（3）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。,3、按分离原理分类 （1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。 （2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。 （3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行

6、分离。 （4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。,二、色谱分析法分类, 6-2 色谱图及色谱常用术语,一、色谱图 混合物样品（A+B）色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。 记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线,二、色谱图中的基本术语,1、基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。 稳定情况下，一条直线。 基线上下波动称为噪音。,二、色谱图中的基本术语,2、色谱峰的高度h （1）峰高h 色谱峰最高点与基线之间的距离。峰高低与组分浓度有关，峰越高

7、越窄越好。,二、色谱图中的基本术语,峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离 半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度,Wb,3、色谱峰宽度,4. 色谱峰面积A 色谱峰与峰底所围的面积。 对于对称的色谱峰 A=1.065h W1/2 对于非对称的色谱峰 A=1.065h(W 0.15+W 0.85)/2,5. 色谱保留值定性的依据,组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t 和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。,（1）死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色

8、谱柱所需的时间。 从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。 气相色谱惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。,5. 色谱保留值定性的依据,t0,(2)保留时间tR 组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。,（3）调整保留时间tR扣除了死时间的保留时间。tR=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。 tR体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,二、色谱图中的基本术语,tR,保留值用体积表示： （4）死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。 V0=t 0F0 柱后出

9、口处流动相的体积流速mL/min,（5）保留体积VR 组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积 VR =t RF 0 （6）调整保留体积VR扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。 VR= tRF 0,二、色谱图中的基本术语,V0、t0与被测组分无关，因而VR . tR更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,（7）相对保留值2，1或i ,s 在相同操作条件下，组分2或组分i对另一参比组分1或s调整保留值之比,二、色谱图中的基本术语,三、分配平衡,在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相

10、中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。,K随T变化，与固定相、流动相的体积无关,1、分配系数 K(浓度分配系数),2、分配比k(又叫容量因子，容量比),组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量 = ms/ mm =svs/ mvm =K vs/vm,k =,k= tR / t0 = (tR-t0) / t0 k= VR / V0 = (VR-V0) / V0,经推导得k与tR之间的关系：,k随T、固定相、流动相的体积变化而变化 k越大，组分在固定相中质量越多， tR越长 K、k越大，组分在固定相中tR就越长,总结：,（1）色谱峰的位置即保留值进行定性分析。 （2）色谱峰的h .A 进

11、行定量分析。 （3）色谱峰的位置及峰的宽度可评价色谱 柱效的高度。, 6-3 色谱法的基本理论,一、塔板理论,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的经验理论塔板理论用于色谱分析法。,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,一、塔板理论

12、,一、塔板理论,对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每一个塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n表示。 n =L/H 或 H=L/n H越小，n越多，分离效果越好，用 H,n 评价柱效。 由塔板理论导出n与Wb ，W 1/2 的关系。 * n = 5.54 (tR /W 1/2)2 =16 (tR/Wb )2,H,n,有时n 大，分离效果也不好，因用tR 内含t0 ，后来改用有效塔板数。,一、塔板理论,n 有效= 5.54 (tR /W 1/2)2 =16 (tR/Wb )2 H有效n 有效,塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法

13、，具有开创性，但有一定局限性。,n理 = 5.54 (tR /W 1/2)2 =16 (tR/Wb )2 H理n 理,前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n 和 H 也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,、速率理论范第姆特方程,1956年，荷兰学者范第姆特（VanDeomter）提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（即：使 H 增大）影响的方程。此方程经简化后写为:,该式称为速率方程（范氏方程）。 下面我们将对公式中的各项进行讨论,u为

14、流动相线速 度cm.s-1，线速 度=柱长/死时间,、速率理论范第姆特方程,、速率理论范第姆特方程,（1）提出了影响的三项因素：涡流扩散项，分子扩散项， 传质阻力项。 （2）在流动相流速一定时， 当、最小时，才小，n 才最高，柱效高。 当、最大时，才大，n 才最小，柱效低。,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,A2dp A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关。 减小：固定相颗粒应适当细小、均匀填充要均匀。,（1）涡流扩散项A,待测组分是以“塞

15、子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,B2D 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。 D为组分在流动相中扩散系数（c m2s-1）。 Dg气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,减小纵向扩散项u 采取措施： 适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。 Dg B2Dg 适当降低柱温c .,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数包括两部分， m +Cs两项组成 Cm 流动相传质阻力系数 组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,m,Cs 固定项传质阻力系数 即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,（3）传质阻力项Cu,2,组分在固定相中扩散系数,固定液膜厚度,减小采取措施： 采用粒度小的填充物