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1、2 蛋白质样品的初级分离,混合物分离,破 碎,选 材,离 心 沉 淀 萃 取 吸 附 膜分离,初 级 分 离,（pretreatment）,第一节 蛋白质样品的选材与破碎,1 制备蛋白质的原材料的选择和处理,微生物：注意生长期 分泌到培养基中代谢产物、胞外酶 菌体含有的生化物质如胞内酶、核酸 植物： 去壳、脱脂、品种、季节、生长发育 动物： 含量丰富的脏器组织为原材料,1.1 天然蛋白质的制备材料,对于处理的材料，若不立即进行试验，应冷冻保存。 对易分解的蛋白质应选用新鲜材料制备。,1.2 重组蛋白质的制备材料,重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式
2、一般可分为： （1）细胞外的分泌表达； （2）细胞内可溶性表达； （3）细胞内不溶性表达（包涵体）,1.3 制备蛋白质的原材料的预处理,为了纯化蛋白质，采用有效的方法进行组织细胞或培养细胞的破碎是提取胞内蛋白质的关键步骤。,1.3.1 细胞的破碎方法,1.3.1.1机械破碎法,1.3.1.1机械破碎法,1高速搅拌珠磨法（fine grinding）：是将细胞悬浮液与研磨剂（如：玻璃小珠、石英砂或氧化铝等）一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出细胞内含物。,影响珠磨破碎的因素：转盘外缘速率：在一定范围内细胞破碎的比速率与转盘外缘速率成正比；细胞浓
3、度：该影响目前还没有定论；磨珠大小及用量：一定范围内，细胞破碎速率与磨珠大小成反比，与磨珠用量成正比。温度：540内对破碎物影响较小，但对于热不稳定性产物，应采用冷却装置控温。流量：提高流量，则降低细胞的破碎程度和释放蛋白的产量。,珠磨法优点：可实现连续操作；缺点：破碎中产生大量的热量会使样品迅速升温，需采取冷却装置。适用于真菌和藻类细胞。,1.3.1.1机械破碎法,2高压匀浆法（homogenization）：是利用高压迫使细胞悬浮液通过针型阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破碎的方法。,操作方式: 可采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难
4、破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,影响因素： 循环次数(N)： Rm / ( Rm-R) =Np 温度：破碎率随温度升高而增加 操作压力：细胞破碎速率与操作压力大小成正比 针型阀与阀座的形状及二者的距离,优点：可多次循环，操作方便、成本较低。因此，该法已大规模应用于多种微生物细胞，尤其是酵母和细菌。,1.3.1.1机械破碎法,3超声波破碎法（ultrasonication）：是利用超声波振荡器发射的1525 kHz的超声波探头来处理细胞悬浮液而使细胞破碎的方法。,破碎原理：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破
5、碎。,影响参数：振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速率（正相关）；细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象；珠粒的大小：细小珠粒利于空穴的形成，并产生辅助“研磨”效应，从而提高破碎速率。其它：如：探头的形状和材料，细胞悬浮液的流速、体积等。,1.3.1.1机械破碎法,4振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)：将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.,机械法破碎细胞的缺陷,需要高能量，并且产生高温和高剪切力，因此易使不稳
6、定产品变性失活； 破碎目标不具专一性（被破碎的有机体或释放产物是非专一的）、易形成碎片颗粒，这为后续分离纯化工作带来难度。,1.3.2.2非机械破碎法,1.3.1.2非机械破碎法,1）化学破碎法：采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。这种用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞内某些组分的方法就称为化学破碎法 。,作用机理：表面活性剂、变性剂等化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。,常用化学试剂：酸、碱、表面活性剂、变性剂、金属螯合剂、和某些有机溶剂（如苯、甲苯）等。,常用化学破碎法：渗透压冲击法、增溶法和脂溶法等。,化学破碎法的特点,存在的问题：时间长，效率低；化学试
7、剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。,优点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。,1.3.2.2非机械破碎法,2）生物破碎法（酶溶法）：是利用生物酶消化溶解细胞壁和膜，从而导致细胞壁膨胀、破裂，释放出内含物的方法。,常用的溶酶：溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等。,自溶：将新鲜的生物材料存放于一定的pH 和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为
8、自溶法。自溶是一种特殊的酶溶方式。,例如：酵母在4550下保温20h左右，即可发生自溶。但该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。另外，自溶的时间较长，不易控制，故在制备生物活性时很少用之。,1.3.1.2非机械破碎法,3）物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。,常用的物理法：反复冻融法、急热骤冷法和干燥法等。,小结,众多细胞破碎方法中，高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时
9、。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱，它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。,各种组织适用的细胞破碎方法,细胞对破碎方法的敏感性,细胞 声波 机械 渗透压 冻融 动植物 + + + + 革兰氏阴性菌 + + + + 革兰氏阳性芽孢菌 + + + + 酵母 + + + + 革兰氏阳性球菌 + - + + 菌丝 - + - + 孢子 - - - -,1.3.1.3选择破碎方法的依据,细胞的处理量 细胞的密度和细胞壁的强度 目
10、标产物对破碎条件的敏感性以及产物在细胞中的位置 破碎程度 产物的稳定性 提取分离的难易,1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,1.3.1.4 细胞破碎确认,细胞破碎率的评价,破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y(%)=(N0-N) / N0100 。注： N0 原始细胞数量；N经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。,细胞破碎率的计算方法,N0和
11、N主要通过直接计数法和间接计数法两种方法获得。,第二节 目标蛋白质的离心分离,离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。,2.1 离心技术的原理,将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为“颗粒”。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。,离心力： Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative cent
12、rifugal force）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。,2.1.1 相对离心力,RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm,通 常： 低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。,计算近似RCF的列线图,2.1.2 沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度（
13、sedimentation velocity）,用S表示。 由于许多生物大分子的S值很小，所以定义10 13 s 为一个沉降单位，1S = 11013 s。 常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1 200之间。,2.1.3 离心条件的确定,离心力 离心时间（与颗粒的沉降时间有关） 温度和pH值（防止欲分离物质的凝集、变性和失活）,n：转子每分钟转数，r/min,2.2 离心机的种类 按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速,离心机的种类,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻 超速离心机均为冷冻型。 使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心
14、头。 使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速， 角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,小台式离心机,离心管,材质：玻璃，塑料 强度：和离心速度相配 大小：和转子配套 高速超速管要加盖,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,2.3 离心分离技术的种类,差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。主要用于分离细胞器和病毒。,差速离心法(differential c
15、entrifugation),密度梯度离心法,亦称平衡密度梯度离心法。密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法。,速度区带离心法,在离心前离心管内预先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。,蔗糖密度梯度离心,等密度离心法,某些密度梯度介质经过
16、离心后会自身形成梯度，如细胞分离液Percoll。待分离样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，颗粒不再移动，形成稳定的区带。,2.4 超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。 超速：50000-120000rpm,大容量冷冻离心机,2.5 应用 根据不同离心目的，分为 制备性离心： 分离纯化和制备 分析性离心： 测分子量、沉降系数、密度、纯度,第三节 蛋白质的沉淀分级
