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1、DNS-氨基酸的制备和鉴定 实验目的1. 了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理2. 掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 实验原理荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：图1：DNS-氨基酸生成反应机理 图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于
2、蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达1010109mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH 在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，即：图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH2 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分
3、离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于1010mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。聚酰胺是类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一
4、CO及NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 实验器材51. 聚酰胺薄膜（77cm）2. 电吹风一个3. 紫外灯一台4. 点样管（4支）5. 吸管6. 量筒7. 烧杯（500ml）8. 铅笔 实验试剂1. DNS-Cl丙酮溶液2. 展层液
5、： V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:1003. 氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液4. 混合氨基酸溶液 实验操作1. DNS标记：取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37水浴中1小时；2. 点样：在距聚酰胺薄膜底端1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，重复2-3次，最多不宜超过5次；3. 展层：1) 配制展层液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；2) 将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加1
6、0ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯；3) 待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干；4. 透射：将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。 注意事项1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不宜超过2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹风机冷风吹干，重复2-3次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；2. 展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；3. 展层后必须经电吹风将膜吹干；4. 使用紫外照射时要注意使用时间短。 实验结果1. 下面是我
7、在本次试验中所得到的聚酰胺薄膜，由于实验中第一次点样过大，所以将聚酰胺薄膜的左下角与其它区域分割开，以免影响展层结果。从左到右依次为丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）和混合氨基酸。 2. Rf值计算：注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为5.10cm。在混合氨基酸中：1. 对于丙氨酸：X=2.62cm,Rf=2.62/5.10=0.51 2. 对于苯丙氨酸：X=0.95cm，Rf=0.95/5.10=0.19各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。 分析总结从实验结果分析可得以下几条结论：1. 由实验原理可知，氨基酸的氨基与
8、DNS-Cl反应后是黄绿色荧光。而Lys含有两个氨基，因此L ys带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl主要与-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的-氨基反应后的DNS-Lys。2. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。3. 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同
9、，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。4. 展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。5. 从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有丙氨酸和苯丙氨酸两种。实验中可导致误差出现的几点：1. 在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中一个出现心形；2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影
10、响实验结果，因严格控制点样点的大小，最好不要超过2mm；还有点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足；3. 点样时若两点之间间隔过小，也会影响实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。 思考题聚酰胺薄膜层析法中对层析液有什么要求，层析液应具备什么特点？就拿本实验来讲，聚酰胺薄膜层析法在分析氨基酸时展层液应具备以下特点：1. 能不同氨基酸形成不同程度的氢键，保证展层过程的顺利完成；2. 展层速度快，单层层析（77cm）一般只需15-20min；3. 不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响实验结果。 影响 Rf值的主要因素1. 物质结构对于Rf值的影响：极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非
11、极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。 2. 溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。3. pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。4. 滤纸对Rf值的影响：
12、滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。 5. 温度对 Rf值的影响： Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf 值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以 Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20至40，温度改变不超过0.5。
