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1、菊花的组织培养,专题3:植物的组织培养技术,（一）植物组织培养的基本过程,一、基础知识,1、植物组织培养的原理：,概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成 完整新个体的潜能。 基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种所 特有全套遗传物质，都有发育成为完整 个体所必需的全部基因。因为它们都是 由同一个受精卵细胞经有丝分裂和分化而来。,细胞的全能性,有丝分裂,受精卵,细胞分化,在个体发育中，细胞在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程叫做细胞分化。,细胞分化,细胞分化的实质：,基因的选择性表达,1.离体 2.一定的营养物质 3.植物激素：主要是生长素和细胞分裂素 4.适宜的外界环境条件：例如无菌
2、、适宜的温度、PH值、湿度、光照等,细胞全能性大小： 受精卵生殖细胞体细胞 植物细胞动物细胞 分化程度低的细胞分化程度高的细胞,2、植物组织培养的条件：,3、植物组织培养的相关概念：,由高度分化的植物器官、组织或细 胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。,脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化成根或芽等器官的过程.,细胞排列疏松而无规则, 是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞.,脱分化：,再分化：,愈伤组织特点:,外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段,（1）不同的植物，培养的难易程度差别很大：,烟草和胡萝卜的组织培养较为容易；,枸杞愈伤组织的芽诱导比较难；,（2）同一种植物材料的年龄、保存
3、时间的长短 等也会影响实验结果,菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。,（二）影响植物组织培养的因素：,1植物材料的影响：,2、营养的影响（培养基）-MS培养基,A、大量元素（无机营养）: N、P、K、Ca、Mg、S,B、微量元素（无机营养）:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co,C、有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖,D、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等,、主要影响蛋白质、核酸的合成； K、 Ca、Mg、S主要影响酶的活性。,蔗糖既是碳源也是维持细胞渗透压的物质； 维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化； 甘氨酸是蛋白质的组成成分，也是有机氮源。,讨论：你能说出
4、MS培养基中各种营养物质的作用吗？同专题 2中微生物培养基的配方相比，MS培养基 的配方有哪些明显的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的 无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗 透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离 体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产 生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养 不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐 混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素 两大类。,常用植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素 生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素 在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强
5、的趋势 激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向,3、植物激素的影响,有利于根的分化，抑制芽的形成,有利于芽的分化，抑制根的形成,促进愈伤组织的形成,激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：,先使用生长素，后使用细胞分裂素,有利于细胞分裂，但不利分化,先使用细胞分裂素，后使用生长素,同时使用,细胞既分裂也分化,分化频率提高,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素类：,赤霉酸（GA3）,激素的使用顺序影响植物细胞的发育方向：,思考：
6、以下培养基出现的现象反应了什么问题？,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,4.pH、温度、光照,pH控制在5.8左右，温度控制在1822,每日用日光灯照射12h。,激素用量的比例影响植物细胞的发育方向：,4.pH、温度、光照的影响,菊花的组织培养pH控制在5.8左右，温度控制在1822,每日用日光灯照射12h。,离体器官组织或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,植物组织培养,不需要光,需要光,植物组织培养过程：,制备MS固体培养基,外植体消毒,接种,培养,栽培,三、实验具体操作过程,移栽,（一）制备MS固体培养基,M
7、S培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4保存的配制好的培养基母液来制备,1、配制各种母液,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2、配制培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml, 配制培养液, 调PH, 培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,琼脂加水并加热熔化，加蔗糖和各种母液,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体
8、消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和真菌（孢子），接种室消毒是至关重要的。用体积分数为70的酒精擦洗工作台并用紫外线照射20分钟。,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需
9、要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成0.51cm的小段，用镊子夹取菊花茎段接种。,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，形态学上端朝上，形态学下端朝下，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,正常苗,污染苗,1、外植体带菌,2、培养基及接种器具灭菌不彻底,3、接种操作
10、时带入,4、环境不清洁,污染途径,思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒 培养温度控制在18-22 每日用日光灯光照12h,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在2025的遮荫环境中，适应57d。试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼
11、苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,3、移栽,幼苗长壮后，移栽到土壤中,固体基质型，含水量高、 蓄水性强、透性好，适合栽培,珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩 。,蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。,（六）栽培,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌） 2、外植体的消毒（酒精、氯化汞） 3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧） 4、无菌箱中的培养； 5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。,在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？,四、结果分析与评价,（一）对接种操作中污染情况的分析 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 （三）是否进行了统计、对照与记录 （四）生根苗的移栽是否合格,五、课题延伸,1一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也 容易进行组织培养,2实例： 芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季,
