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1、1高氧液对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用第四军医大学西京医院麻醉科(巩固,陈敏,熊利泽,雷毅,郑恒兴,曾毅); 解放军 304 医院麻醉科（张英民）通讯作者：巩固 硕士研究生; 责任作者: 张英民通讯地址：陕西省西安市长乐西路 17 号第四军医大学西京医院麻醉科联系电话：029-3375343 3375337E-mail: 正文字数：3774；表数：42高氧液对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用巩固 张英民 陈敏 熊利泽 雷毅 郑恒兴 曾毅摘要 目的 研究高氧液对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用及对HSP90 表达的影响。方法 雄性新西兰大白兔 20 只，随机分成对照组(C 组，n=10)及高氧液组
2、（H 组， n=10） 。夹闭腹主动脉肾下段 20min，建立兔脊髓缺血模型。H 组于缺血前 20min 持续以 20mL/kg/h 恒速静脉输入高氧液,直到再灌注后 20min；C 组则采用同种方法静脉输入等容量生理盐水。再灌注后4、8、12、24 和 48h 分别对动物后肢运动功能评分。再灌注 48h 后，处死动物取脊髓（L 5） ，石蜡包埋切片行组织病理学观察及免疫组织化学染色，并 按 照McCarthy 等 的 方 法 对 免 疫 组 化 染 色 结 果 进 行 分 析 。结果 高氧液组神经功能评分在各时间点均明显高于对照组 (p0.05)。见表 1。二、神经功能评分 高氧液组后肢神经
3、功能评分在各时间点均明显高于对照组（ p0.05） 。缺血 20min 再灌注 48h，对照组所有动物表现为后肢瘫痪，高氧液组均能站立或正常跳动（表 2） 。三、免疫组化结果 对照组及高氧液组脊髓皮质均可见 HSP90 的表达。高氧液组 HSP90 表达明显增加，免疫阳性细胞大致正常，分布密集，整个细胞呈现棕色；对照组皮层区仅有少量免疫阳性细胞 ， 分 布 稀 疏 ， 染 色 较 浅 ； 高 氧 液组 阳 性 细 胞 数 及 百 分 率 与 对 照 组 比 较 有 显 著 差 别 (表 3， 4)。四、组织病理学观察 对照组光镜下显示，腰膨大段脊髓有明显的改变，损伤严重，呈液化性坏死，形态正常
4、的脊髓前角运动神经元细胞稀少，核固缩，部分核发生裂解，神经细胞周围有许多空泡形成。高氧液组光镜下显示，腰膨大段脊髓组织损伤明显减轻，形态基本正常的脊髓前角运动神经元细胞较多, 胞体呈多角形, 核仁清晰,可见尼氏体。讨 论本结果显示，H 组缺血再灌注后 4，8，12，24 及 48h 时的神经功能评分明显高于 C 组；与 C 组相比，H 组脊髓组织损伤较轻，形态基本正常的脊髓前角运动神经元较多，表明高氧液对兔脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用。我们以前的研究表明高氧液能够明显增高血浆中 PGI2的含量，降低 TXA2的含量，改善脊髓缺血再灌注后血浆 TXA2- PGI2平衡失调，从而扩张脊髓微血
5、管，改善脊髓微循环，增加脊髓区域血流量 2。氧液对脊髓缺血再灌注损伤后皮质HSP90 表达的变化尚未见报道。近年来，研究一致认为 HSP 是生物在长期进化过程中保留下来的自我保护机制，具有极重要的“分子伴侣”作用。在细胞应激后 HSP 基因与变性蛋白结合，通过调节 ATP 酶，维持蛋白质的四级结构，促进正常核糖体装配、合成，加速核仁形态恢复，提高细胞对应激的耐受性，起到保护细胞的作用。这一保护作用现已在肝、肾、肺和心脏等组织细胞中得到证实。在正常状态下，某些HSP 具有一定量的基础表达，可帮助新合成蛋白质的折叠、移位；在应激状态下，HSP 表达明显增多，可使变性蛋白质复性或促进严重损伤蛋白质的
6、降解，因而能保护抵抗各种损伤 3。验结果表明，高氧液的保护机制与脊髓缺血再灌6注损伤后脊髓皮质 HSP90 表达上调有关。推测 HSP90 通过以下途径发挥作用：与靶蛋白的活性功能集团结合，使其维持所谓“无活性稳态” ，避免这些结构与胞浆中的其它生物分子形成聚合体而失活。HSP90 与受体功能的维持、细胞信号传递具有密切的关系 4，能使在各种应激反应中积累的误折叠蛋白再折叠，并可促进已产生突变的蛋白质降解。此外，还参与激素受体、其它转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节5等作用。虽然目前关于 HSP90 对神经组织缺血再灌损伤是否有保护作用仍无定论，但许
7、多研究表明 HSP90 在神经元中早期有效聚集，是其能耐受缺血损伤而得以生存的一个重要标志，在缺血晚期如 HSP90 基因在神经元中仍持续表达，则造成细胞其它重要蛋白合成受影响，这可能是造成延迟性神经细胞死亡的一个重要原因。高氧液是氧气通过高氧医用液体治疗仪活化后，溶入生理盐水制成氧分压达到 90100kPa 及臭氧浓度为 1020mg/L 的高氧液体。高氧液中臭氧浓度为1020mg/L，此浓度临床使用，安全性高，对微循环有显著的改善作用 6。其作用的可能机制是：1、高氧液含有活性氧成分，研究认为 7，在细胞外给予活性氧可提高细胞的抗氧化能力，并提高 SOD 的活性；2、高氧液可减少 NO 的
8、含量，活性氧作为第二信使几乎与所有信号传导途径相关，但其具体细胞外作用途径尚不清楚 8。高氧液减少 NO 的含量可能是通过某种信号传导途径而抑制NOS 的活性。3、高氧液本身所具有的高分压氧的作用不可忽略。缺血再灌注损伤时组织所产生的病理性氧依赖 9，使得神经元细胞对氧需求增加，高氧液中的高分压氧比动脉血中血氧分压高 5 到 6 倍，且其释放不受组织酸中毒的影响，为神经元细胞提供足够的氧需求，加快了顿抑神经元的恢复等。但具体的机制尚待进一步研究。参考文献1 Alpagut U, Dayioglu E. Anterior spinal artery syndrome after infraren
9、al abdominal aortic surgery. J Cardiovasc Surg (Torino) 2002;43(6):865-8682 Dong HL, Xiong LZ, Zhu ZH, et al. Preconditioning with hyperbaric oxygen and hyperoxia induces tolerance against spinal cord ischemia in rabbits. Anesthesiology, 2002;96:907-9123 Tarlov IM. Acute spinal cord compression para
10、lysis. J Neurosurg, 1972;36:10-20.4 巩固，桑韩飞，张英民，等. 高氧液对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用. 第四军医大学学报 2003;24(10):948-953.5 Xiao X, Benjamin LJ. Stress- response proteins in cardiovascular disease. Am J Hum Genet,1999;64(3):685-90. 6 alea Lauri J,atchman DS,atz DR. The role of the 90-kDa heat shock protein in cell cycle
11、control and differentiation of the monoblastoid cell line U937. Exp Cell Res. 71996 ;226(2):243-54.7 徐礼鲜，吴利平，张惠，等.高氧液提高乏氧血氧含量及相关基础研究. 中国药理学通报， 2002，18（5）：560-562.8 eralta C, Leon OS, Xaus C, et al. Protective effect of ozone treatment on the injury associated with hepatic ischemia-reperfusion: antio
12、xidant-prooxidant balance. Free Radic Res, 1999;31(3):191-196.9 enei P， Pen JM， Nerriere-Dauin V， et al. Intracerebral implantation of NGF-releasing biodegradable microspheres protects striatum against excitotoxic damage. Exp Neurol， 2000， 161:259-272.表 1 生理学参数（ S,n=10）x分组近端 MAP(mmHg)远端 MAP(mmHg)心率肛
13、温(C)PaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)血糖(mg/dl)H组缺 血 前 20min 8312 741.1 25822 38.10.5 25.91.5 4.90.4 13618缺 血 10min 9512 102 23917 38.00.4 28.32.5 4.80.3 13916再 灌 注 20min 8114 7212 24716 38.30.5 29.02.8 4.60.5 14211C组缺 血 前 20min 741.8 661.3 25513 38.20.4 25.31.9 5.10.5 13315缺 血 10min 8614 1.02 23916 38.00.5 28.1
14、2.3 4.90.6 13516再 灌 注 20min 7216 641.4 24313 38.20.4 29.22.5 4.60.7 13812表 2 再灌注后兔 4，8，12，24，48h 神经功能评分(n=10)神经功能评分再灌注时间（h） 组别 0 1 2 3 4 总评分对照组 3 4 3 0 0 104高氧液组 0 3 3 4 0 21*对照组 3 2 3 2 0 148高氧液组 0 0 5 5 0 25*对照组 5 2 3 0 0 612高氧液组 0 0 4 4 2 28*对照组 5 5 0 0 0 524高氧液组 0 0 4 4 2 28*对照组 6 4 0 0 0 448高氧液
15、组 0 0 3 4 3 30*8注：与对照组比较*0.01表 3 再灌注 48 小时脊髓前角正常神经细胞计数(n=10)动物序号组别1 2 3 4 5 6 7 8 9 10中位数对照组 9 13 12 18 9 20 10 14 11 8 11(8-20)高氧液组 48 43 59 63 70 35 51 38 47 45 47(35-70)*注：与对照组比较*0.01表 4 再 灌 注 48h 后 脊 髓 皮 质 HSP90 阳 性 细 胞 数 (n=10)组 别 阳 性 细 胞 数 比率（%）对照组 115.0625.9 0.47高氧液组 2923.6618.7 4.38*注：与对照组比较*0.01.9
