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1、仪器分析,生物工程系,任务五 高效液相色谱仪的使用,了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围 了解高效液相色谱仪的构造 掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法,学 习 目 标,一、 概 述,高效液相色谱法（HPLC）：以气相色谱为基础，在经典液相色谱（LC）实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 （一）HPLC的特点 （二）与经典LC相比HPLC的优点 （三）HPLC的适用范围,高压压力可达150 300kg/m2； 高速流速为0.110.0mL/min； 高效柱效高，在一根柱中同时分离成分可达100种； 高灵敏度紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。,（一）HPLC的
2、特点,（二）与经典LC相比HPLC的优点,速度快通常1530min一个样，某些样品5min可完成； 分辨率高可选择固定相和流动相达到最佳分离效果； 灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg； 柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物； 样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏。,（三）HPLC的适用范围,适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品 ； 应用范围广泛，适用于医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等多个领域； 在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占7080%。,一,二、 结 构,（一）工作流程,高压输液系统,色谱柱系统,（数据记录处理系统）工作站,
3、检测系统,进样系统,动画,（二）工作系统,1、 高压输液系统 主要部件：贮液器、过滤器、 高压输液泵、梯度淋洗装置,（二）工作系统,2、进样系统 流路中为高压力工 作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。,动画,（二）工作系统,3、色谱柱系统 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,（二）工作系统,4、检测器系统 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 光电二极管阵列检测器,（二）工作系统,5、色谱工作站 以VI2010色谱工作站（软件操作示范）为例：此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子
4、设备连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。,三、 使 用 技 术,准 备,清洗、关机,冲洗柱子冲洗管路关主机 关电脑 关电源,开机、进样,流动相 标液 样液 柱子选择 仪器检查,开电脑、主机、工作站 参数设置 方法建立 进样,操 作 步 骤,1、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。 2、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。 3、准备样品和标准溶液，用合适的0.45m滤膜过滤。 4、检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管道是否连接正常。,准 备,接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、多元泵、检测器。待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器，主机、最后打开色谱工作
5、站。 1、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。 2、更换流动相并排气泡。 3、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观察压力值变化、观察基线变化。 4、进样：自动进样、手动进样。,开机、进样,1、分析结束，数据处理、打印报告。 2、关闭柱温箱和检测器，然后再用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统。 3、冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵。 4、关闭液相装置，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。,清洗、关机,四、 数 据 分 析,（一）谱图判断 （二）结果分析,（一）谱图判断,分离度一般应1.5； 重复性两次谱图的峰面积应相差不超过1%；
6、理论塔板数应规定的理论塔板数目； 拖尾因子0.95T1.05； 保留时间对照与样品的主成分保留时间应大致一致。,（二）结果分析,1、定性方法 利用已知标准品定性 利用检测器的选择性定性 利用紫外检测器全波长扫描功能定性 2、定量方法 归一化法 外标法 内标法,课后思考题,1、外标法定量与内标法定量有何差别？ 2、流动相在使用前为何要经过脱气处理？,实训六 高效液相色谱仪的使用,一、 实训目的 二、 实训原理 三、 实训材料 四、 实训步骤 五、 结果分析 六、 注意事项,一、实 训 目 的,1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理； 2、掌握高效液相色谱仪的使用方法； 3、学会用单点外标法进行数
7、据处理和结果分析。,二、实 训 原 理,利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱中后，组分就在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各种组分的吸附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序进入色谱柱，产生的离子流信号经放大，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。,三、实 训 材 料,1、主要仪器设备：Agilent高效液相色谱仪，Hypersil ODS-C18柱（5m，4.6*100mm），MWD检测器，超声波清洗器，膜过滤装置。 2、主要试剂：甲醇（色谱纯），0.02mol/L乙酸铵溶液，25g/mL苯甲酸标准溶液
8、。 3、样品测试溶液：市售碳酸饮料。 所用溶液均经过0.45m膜过滤。,四、实 训 步 骤,1、取市售碳酸饮料约10mL于50mL烧杯中，超声脱气30min后，准确吸取1mL，经滤膜过滤至10mL比色管，以经滤膜过滤的高纯水定容至5mL。 2、色谱条件：柱温25；检测波长230nm； 进样量20L；流速1.0mL/min； 流动相 甲醇：乙酸铵溶液=5:95,四、实 训 步 骤,3、开机，打开色谱工作站。 4、打开脱气阀，以5mL/min流速对流动相进行脱气。 5、脱气完毕后，调节流动相流量为1.0mL/min，切换脱气阀，打开柱温控制开关，打开UV检测器开关。按色谱条件设置相应参数。 6、建
9、立方法和进样序列。,四、实 训 步 骤,7、待基线平稳后，调用方法和序列，开始测样。 8、测样结束，打印图谱报告。 9、关闭检测器和柱温箱，清洗色谱柱及管路，以1.0mL/min的流速，先以水清洗色谱柱20min，再以甲醇清洗色谱柱30min。 10、关闭色谱工作站、关机，作好使用记录。,五、结 果 分 析,1、定性分析 以保留时间定性，填写下列表格。,五、结 果 分 析,2、定量分析 以峰面积定量，根据公式计算样品中苯甲酸的含量。 W样品中苯甲酸的含量， g/mL； A样品中被测物质的峰面积； As标准样品中被测物质的峰面积； C标准样品的浓度， g/mL； V2样液定容体积，mL； V1所
10、取样液体积。,六、注 意 事 项,1、流动相必须使用色谱纯试剂，使用前用0.45m膜或更细的膜过滤，并超声脱气，恢复到室温后使用。 2、不能用纯乙腈作流动相，防止单向阀粘住导致泵不进液。 3、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存，应该用有机相（如甲醇等）保存。 4、C18柱绝对不能进蛋白样品、血样、生物样品。,六、注 意 事 项,5、注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 6、更换流动相时，应先将吸滤头部分放入烧杯中，边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶相的流动相时要用异丙醇过滤一下。 7、气泡会致使压力不稳，重现性差，在使用过程中尽量避免产生气泡。,实训技能考核标准,
