基因工程全.

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1、基因工程的概念,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说,就是按照人们的意愿,把一种生物的某种基因提取出来,加以修饰改造,然后放到另一种生物的细胞里,定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基因工程的概念,第一节 基因工程的原理,思考:蓝色妖姬如何培育的?,“蓝色妖姬”最早来自荷兰是一种加工花卉。它是用一种对人体无害的染色剂和助染剂调合成着色剂,等白玫瑰(或白月季)快到花期时,开始用染料浇灌花卉,让花像吸水一样,将色剂吸入进行染色。 据花卉专家介绍,目前世界上极少有自然生长

2、的蓝色玫瑰花,现在市场上出售的“蓝色妖姬”都是人工染色后的产物。比较正规的“蓝色妖姬”是在花卉的成长期开始染色,颜色能均匀地附着在花瓣上,看上去比较自然;部分商贩直接将普通的白玫瑰花采摘后染成蓝色,颜色不自然,也容易掉色。 2008年11月1日闭幕的东京国际花卉博览会上,全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。这种蓝玫瑰是转基因玫瑰,被植入三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素产生的基因,花瓣因而自然呈现蓝色。,基因工程培育蓝色玫瑰的简要过程:,普通玫瑰(无蓝色),蓝色基因,与运载体DNA拼接 导入,普通玫瑰细胞(含蓝色基因),蓝色玫瑰(有蓝色),上述培育蓝色玫瑰的关键步骤是什么?,三色紫罗兰,提取,

3、基因工程培育蓝色玫瑰的关键步骤:,关键步骤一:,从三色紫罗兰中提取蓝色基因,关键步骤二:,蓝色基因与运载体DNA连接,关键步骤三:,蓝色基因导入受体(普通玫瑰)细胞,解决培育蓝色玫瑰的关键步骤需要哪些工具?,关键步骤一的工具: 关键步骤二的工具: 关键步骤三的工具:,基因的剪刀限制酶 基因的针线DNA连接酶 基因的运载工具运载体,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断,由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性核酸内切酶。,4000种。,形成两种末端,(一)、

4、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶,限制性内切酶作用过程,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开。,限制酶,什么叫黏性末端?,限制酶,什么叫黏性末端?,什么叫黏性末端?,被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,他们之间正好互补配对,这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端?,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时,切开的DNA两条单链的切口,是平整的,这样的切口叫平末端。,限制酶切割的是哪个部位的键?,T,磷酸二酯键,A,1.连接酶的作用:将互补配对的两个黏性末端连接起来,使之成为一个完整的DNA分子。,问题,用DNA连接酶连接两个相同的黏性

5、未端要连接几个磷酸二酯键?,2.连接的部位:磷酸二酯键,不是氢键。,二、 “分子缝合针” DNA连接酶,磷酸二酯键,DNA连接酶的作用过程,DNA连接酶的作用过程,返回,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 答:不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种:一种是从大肠杆菌中分离得到的,称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到,称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同,都是连接双链DNA的缺口(nick),而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成),那么,二者的差别主要表

6、现在什么地方呢?,(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 此外,二者虽然都是由蛋白质构成的酶,但组成和性质各不相同。,(三)、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,(1)运载体的作用,作为运载工具,将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 利用运载体在受体细胞

7、(棉花细胞)内,对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。(随载体的复制而复制),(2)作为运载体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 具有一个或多个限制酶切点,以便与外源基因连接。 具有某些标记基因,便于进行筛选。 必需是安全的,不会对受体 细胞有害。 大小应适合,便于提取和操作,(3)常用的运载体,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,细菌细胞质的质粒 噬菌体的衍生物 动植物病毒,注意:真正用作运载体的质粒都 是人工改造过的。,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒, 其中常含有抗药基因,如四环素的 标记基因。质粒的存在与否对宿主 细胞生存没有决

8、定性作用,但复制 只能在宿主细胞内成。,质粒是一种裸露的、结构简单、独 立于细菌染色体(即拟核DNA)之外, 并且具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。,质粒是基因工程最常用的运载体。,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体:,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,获取目的基因是实施基因工程的第一步。 目的基因主要是指_ 获取目的基因的常用方法 从基因文库中获取 (基因组文库,部分基因文库) 利用PCR技术扩增目的基因 (变性,复性,延伸) 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成,编码蛋白

9、质的结构基因,基因文库,基因组文库,部分基因文库(如:cDNA文库),1.基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库,(一)从基因文库中获得目的基因,2.基因文库的构建方法,鸟枪法:,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接载入,受体细胞 (形成受体菌群),产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),(一)从基因文库中获得目的基因,基因组DNA文库的构建,鸟枪法:,(直接分离法),用 限 制 酶 切 成 许 多 片 断,该法最大的缺点是带有很大的盲目性,工作量大,成功率

10、低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。,反转录法: 以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,核酸酶H,2.基因文库的构建方法,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),(一)从基因文库中获得目的基因,根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,根据已知蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序

11、列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,2.基因文库的构建方法,(一)从基因文库中获得目的基因,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?,操作简便广泛使用,工作量大,盲目,分离出来的有时并非一个基因,专一性较强,操作过程麻烦,mRNA很不稳定,要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因, 概念:PCR全称为_,是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件:_、 _、_ (做启动子)、 _,原理:_,方式:以_方式扩增,即_(n为扩增循 环的次数),结果:,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA

12、聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程:,a、DNA变性(90-95): 目的基因DNA受热变性,解链,b、复性(55-65): 引物与单链互补结合,c、延伸(70-75): 合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性:加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火:冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸:加热至7075以目的基因为模板,合成互补的新DNA链,(二)利用PCR技术扩增目的基因,(三)通过DNA合成仪直接合成目的基因,DN

13、A合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时,可采用此种方法。,质粒,目的基因,限制酶,二、基因表达载体的构建,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子(重组质粒),同一种,4.过程:,二、基因表达载体的构建,1. 目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A B C D,D,5.基因表达载体的组成:,复制原点+目的基因+启

14、动子+终止子+标记基因,二、基因表达载体的构建,基因表达载体的组成: 目的基因、启动子、终止子、标记基因,启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位。RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA,进而获得需要的蛋白质。,终止子:位于基因的尾端,也是一段有特殊结构的DNA 片段,使转录在所需要的地方停止下来。,标记基因:为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因, 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,二、基因表达载体的构建,1、(多选)一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A

15、启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位,是起始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段,对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,补:原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,:编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:,启动子,真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子:能编码蛋白质的序列 内含子:不能编码蛋白质的序列,:有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,非编码序列:,包括非编码区和内含子,非编码序列:,包括非编码区和内含子,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射

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