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1、,PCR技术 STR技术 组织配型技术 测序技术 在临床检验的应用进展 中日联谊医院科研中心 吴晓冬 wuxiaodong701,PCR技术在 临床检验中的应用,PCR技术简史： 1983年，提出了PCR的概念 1985年，Mullis等提出了耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1988年在Science上发表了关于TaqDNA聚合酶的论文 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖,PCR技术的分类,免疫PCR（ImmunoPCR
2、，I-PCR） 套式引物PCR（Nested primer PCR） 反转录 PCR（Reverse transcription PCR， RT-PCR） 反向PCR（Reverse PCR） 标记PCR（Labelled primers PCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 玻片PCR（SlidePCR） 定量PCR 锚定PCR（Anchored PCR）,实时荧光定量PCR,1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得
3、到广泛应用。,定量与常规的差别,常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析。 定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析。,实时荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,Threshold 即能够检测到的荧光信号域值，通过比较不同样品达到域值所需的循环数，从而可以比较不同样品的浓度。 CT (Cycle Threshold) -在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，C
4、t值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,Monitoring Real-Time PCR Three Phases of PCR,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性。,实时荧光定量PCR原理,Ct值与起始模板的关系 ：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光定量标准曲线,实时荧光定量PCR
5、原理,荧光化学 ： 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。,Taqman荧光定量PCR技术,TaqMan探针,Target sequence,R = 报告荧光 (FAM or VIC 染料) Q = 淬灭荧光 (NFQ),5,3,Taqman荧光定量PCR技术,探针杂交,反向链引物,正向链引物,5,3,5,3,5,5,Taqman荧光定量PCR技术,正向链引物,反向链引物,5,3,5,3,5,5,退火，延伸,5,3,5,5,3,5,替 换,Taqman荧光定量PCR技术,5,3,5,5,3,5,剪 切,R,Taqman荧光定量PCR技术,5,3,5,5,3,5,延伸结束
6、,R,Taqman荧光定量PCR技术,PCR Amplification Plot,FAM Dye signal from sample,VIC Dye signal from IPC,CT value = 23.35,CT value = 28.06,Smaller the CT number the more DNA detected,定 量 结 果,ng/L,由标准曲线计算样品量,CT,(Log N) initial concentration,DNA标准品扩增图,50 ng/ L,0.023 ng/ L,Smaller the CT number the more DNA detect
7、ed,Used to Calculate CT,样品扩增图,CT = 23.35,CT = 28.01,CT = 30.85,样本未检测到DNA,PCR技术在医学上的应用,病原体的检测 基因遗传病的诊断 肿瘤基因的检测和诊断 法医学研究,病原体的检测,人类免疫缺陷病毒（HIV） 乙肝病毒(HBV)及其分型 丙肝病毒（HCV）与戊肝病毒（HEV） 人乳头瘤病毒（HPV） 及其分型 结核杆菌 巨细胞病毒 EB病毒 幽门螺杆菌 其它病原微生物:脑膜炎双球菌、淋球菌、肺炎支原体、寄生虫 等,镰形细胞贫血 由于基因突变而引起Hb的结构异常，正常人Hb的珠蛋白链第6位上谷氨酸被缬氨酸代替而形成血红蛋白S(
8、HbS)所致。 Chehab等设计一对引物，扩增后正常人有2个片段，镰形细胞贫血的纯合子，仅有一个片段；杂合子有3个片段。 杜氏营养不良症（DMD） 60的DMD患者存在着dystrophin基因缺失 甲型血友病 为X性连锁隐性遗传 另外，一些有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血压等,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,肿瘤基因的检测和诊断,恶性肿瘤分子标记的检测：如慢性粒细胞性白血病(CML）。CML的费城染色体(即ph染色体）是标记染色体; 融合基因BCR-ABL的检测 癌基因、抗癌基因缺失与点突变研究 肿瘤相关病毒基因的研究： HBV与原发性肝癌；EBV与鼻咽癌、何
9、杰金氏病等有关；近年来用PCR技术在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Kaposi肉瘤等组织中均检出有HCMV DNA顺序，提示 HCMV具有潜在的致癌性。,法医学研究,利用罪犯在犯罪现场留下的任何少量标本，如一根毛发、一滴血液、极小的血斑和精斑等其它分泌物或组织块等进行PCR扩增，结合指纹图谱等分析可进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定等。,STR技术在 临床检验中的应用,DNA指纹技术（DNA Profile） 人类基因组超过90的序列为重复序列，它们不编码mRNA前体或其它RNA，由串联、重复排列而成的DNA序列构成数量可变的串联重复序列，其串联重复单位的数目在人群中存在较大差异性，具有高度多态性。重
10、复单位长度为1070bp的称为小卫星DNA.,DNA指纹图的遗传规律,遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。 个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组织，其DNA指纹图谱是一致的。 群体遗传学特征：无法判断各靶基因座位基因型，因此不能按照传统遗传学方法调查人群中等位基因数和分析等位基因的频率。,不同的个体有不同的DNA指纹图,DNA指纹图技术存在的缺点,无法确定等位基因。 对任何一条带，无法确定是由纯合子或杂合子产生。 无法确定每条带所代表的基因座即染色体定位。 无法确定基因座之间的独立性。 对检材要求较高。,STR（short tand
11、em repeat）,短串联重复序列，也叫微卫星DNA，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列。其核心序列为2-6bp，重复次数通常在15-30次。 DNA片段长度为100-350bp。它们也是染色体上的来自父母的配对的等位基因。,2-6bp,由于每个人STR基因座的核心单位重复次数不同，造成它们的DNA片段长度不同，因此构成了人群中极为高度的STR基因座的DNA片段长度的多态性。 多数STR基因座具有多态性，其高度多态性主要源于核心序列重复次数的个体间差异，这种差异在基因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律。,优点： 仅需少量模板DNA，灵敏度、扩增效率高。 第二代法医DN
12、A指纹技术的核心 个体识别率高 STR检测和以往的DNA水平的检测相比，由于它在人类基因组中分布极为广泛，且片段小，等位基因多，杂合度高。 如两个无关个体在14个STR基因座基因型完全相同的可能性仅为110-14，理论上讲目前地球上60亿人口中没有任何两无关个体在这14个STR基因座基因型完全相同。,获得检材 中细胞,经物理化学作用释放DNA,经过一系列实验操作及仪器分析得到分型结果,应用PCR反应的对DNA进行几何级数放大,统计学计算得出结论,组织配型技术的 实验诊断进展,器官移植（organ transplantation ） 由于不同种族、不同个体的HLA型别千差万别，必须采用一定的方法
13、对捐献者和患者的HLA型别进行确定，从而选择与患者HLA相配合的捐献者进行移植，这是器官移植治疗成功的关键。,概 述,HLA “人类白细胞抗原”,HLA, 英文全称 Human Leucocyte Antigen。 HLA作为人体组织细胞的遗传学标志，在机体的抗原 识别、提呈、免疫应答调控以及抗感染免疫等方面发挥 重要作用。 HLA是导致移植物排斥的主要抗原，HLA配型是影响器 官移植存活率的重要因素之一。长期以来人类白细胞抗 原(HLA)又被称为移植抗原。,HLA基因是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因 HLA系统的基因位于第六号染色体的短臂上。HLA抗原根据不同的基因位点分为一类
14、、二类和三类抗原,HLA “人类白细胞抗原”,一类抗原: HLAA，B，C 位点 二类抗原：HLADR，DQ，DP 位点 三类抗原：补体,HLA的多态性及其遗传规律,正常情况下，人体细胞是二倍体型的。染色体上HLA各位点的等位基因全部为共显性的。 由于在一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，因此HLA常作为一个整体遗传给子代。 在一条染色体上HLA各位点的基因组合称HLA单倍体型(Haplotype)，如：A1，B8，DR17。 在细胞膜上能检测出的抗原特异性，则称为表现型(Phenotype)，如：A1，A11，B8，B55，DR17，DR7。 两个同源单倍体型构成HLA的基因型 (Gen
15、otype):如A1，B8，DR17（母亲），A2，B7，DR15（父亲）。,HLA的多态性及其遗传规律,两条染色体，一条来自父亲，一条来自母亲。每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。 一般来说，两个同胞之间具有相同基因型的机会为25%；两个单倍体型完全不同的占25%；一个单倍体型相同的是50%。,HLA的主要应用,HLA与器官移植 HLA与临床疾病 HLA与人类学的研究 HLA与亲子鉴定,HLA在器官移植中的应用,1954年，美国Murry医生为一同卵双生姐妹进行肾移植获得成功。 1963年，美国医学家进行人类历史上第一例肝移植 1963年，美国另一位医生做了第一例肺移植 1
16、967年，南非开普敦的一所医院完成了第一例心脏移植 1968年，美国几位科学家又进行了第一例心肺联合移植 肾移植受者与供者HLA-A、HLA-B、DR三个位点抗原相同与否器官存活率的差别：第一年12%，第三年为19%，第十年为33%。 尤其是DRB1的相配，可以提高一年存活率610%。 人类白细胞抗原（HLA）主要配型：HLA-A、B、DR位点,一 移植前后的常规检测 血型、血尿便常规、肝肾功能、血电解质、出凝血功能、血气分析、感染免疫、细菌、真菌、病毒检测 二 移植术前相关检测 HLA抗原检测、群体反应性抗体（PRA）、淋巴细胞毒实验、细胞色素P450酶系3A亚家族中CYP3A5 基因检测等 三 移植术后相关检测 PRA、外周血T淋巴细胞及其亚群、
