pmd18-t vector cloning kit 说明书

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1、 研究用研究用 Code No. 6011Code No. 6011 说明书说明书 pMDpMD1818- -T Vector T Vector Cloning KitCloning Kit v20v201 1606606DaDa 目目 录录 内内 容容 页页 码码 制品说明制品说明 1 1 制品内容制品内容 1 1 保保 存存 1 1 纯纯 度度 1 1 用用 途途 1 1 pMD18pMD18- -T VectorT Vector 的结构的结构 1 1 实验操作实验操作 2 2 Control DNAControl DNA 片段的克隆实验片段的克隆实验 2 2 一般一般 DNADNA 片段

2、的克隆实验片段的克隆实验 2 2 一种可供选择的快速克隆法一种可供选择的快速克隆法 3 3 相关说明相关说明 4 4 使用注意使用注意 4 4 Q Q&A&A 5 5 -1- 制品说明制品说明 pMD18-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由 pUC18 载体改建而 成，在 pUC18 载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的 3端添加“T”而成。因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都有 在 PCR 产物的 3末端添加一个“A”的特性，所

3、以使用本制品可以大大提高 PCR 产物的连接、克隆效 率。 由于本载体以 pUC18 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC18 载体相同的功能。此外，本制品中的 高效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化， 大大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。 制品内容制品内容（2020 次量）次量） pMD18-T Vector（50 ng/l） 20 l1 支 Control Insert（50 ng/l） 10 l1 支 Solution I* 75 l2 支

4、* 使用时请于冰中融解。 保保 存：存： -20 纯纯 度度 Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。 用用 途途 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。 对克隆后的 PCR 产物使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers 进行 DNA 测序。 pMD18pMD18- -T VectorT Vector 的结构的结构 -2- 【pMD18-T Vector 相关位点说明】 Cloning site 425 BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site

5、352-375 BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site 484-507 LacZ operator 146-475 ColE1 ori 873-1461 Ampr 1632-2492 实验操作实验操作 Control DNA 片段的克隆实验 A） 操作方法 1） 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。 试剂 使用量 pMD18-T Vector*1 1 l Control Insert*2 1 l dH2O 3 l 2） 加入 5 l（等量）的 Solution I。 3） 16反应 30 分钟。 注） 室温（25）也能正常进行连

6、接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 4） 全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5） 42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6） 加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8） 挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 B） 结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下， 使用的感受态细胞的转化效率为： 1.5108 cfu/

7、g pUC19 DNA。 Control Insert 连接/转化效率 （cfu/g Vector） 白色菌落比率 （%） 效率（%）* 1.7106 98.1 90 以上 1.1105 40.4 0 * 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。 一般 DNA 片段的克隆实验 1） 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。 试剂 使用量 pMD18-T Vector*1 1 l Insert DNA*3 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l -3- 2） 加入 5 l（等量）的 Solution I。 3） 16反应 30 分钟。

8、 注） 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段 PCR 产物（2 kb 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 4） 全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5） 42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6） 加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 7） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8） 挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 一

9、种可供选择的快速克隆法*4 1） 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。 试剂 使用量 pMD18-T Vector*1 1 l Insert DNA*3 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 2） 加入 5 l（等量）的 Solution I。 3） 16反应 30 分钟。 注） 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段 PCR 产物（2 kb 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 4） 取 2 l 上述连接液（10 ng Vector DNA）加入到 mi

10、crocentrifuge tubes 中，冰上冷却 2 min。 5） 取 50 l E.coli JM109 Competent Cell 加入到上述 microcentrifuge tubes 中，混匀并冰浴 5 min。 6） 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在 37预热 30 分钟） ，形 成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 *1 pMD18-T Vector 的使用量 取 0.5 l 实验也可得到满意的结果。 实际操作时， 可按实验需要确定 T 载体的使用量。 pMD18-T Vector 1 l（50 ng）的摩尔数约为 0.03 p

11、mol。 *2 Control Insert Control Insert 为 500 bp 的 3末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 l（50 ng） 的摩尔数约为 0.15 pmol。 *3 Insert DNA 的使用量 在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为：1：210。 *4 快速克隆法 该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆 DNA 片段的方法，可 以满足一定客户的需求。 -4- 相关说明相关说明 1. 感受态细胞的选择。 转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率1108 cfu/

12、g pUC19） ，这样才可能得到比较理 想的阳性克隆。 如果需要进行蓝白筛选时， 宿主细胞必须具有正确的基因型 （F编码的 LacZM15 ） 产生 Fragment，才可能和载体 DNA 产生的LacZ 多肽相结合，表现出 -半乳糖苷酶活性（ -互补性） 。 2. Insert DNA 的要求。 Insert DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶 回收时可使用 Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762） 。 3. Insert DNA 使用量的计算方法。 进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比

13、一般为 1：210，我们可以根据自己的实验情况 选择合适的 Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。Insert DNA 使用量的计算方法如下： Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 数660Insert DNA 的 bp 数 本载体 1 l（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。 4. 阳性克隆的检测。 DNA 片段成功插入至 pMD18-T Vector 中后，一般情况下-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克 隆体在含有 X-Gal、 IPTG、 Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。 但有时比较短的 DNA 片段插入载体时，基因的读码

14、框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报 道称，2 kb 的 DNA 片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落 时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用 PCR 的方法，扩增用引物可以使用 BcaBEST Sequencing Primers，可以对菌体直接进行 PCR 扩增。 5. 阳性对照实验。 为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法， 使用试剂盒中提供的 Control Insert，可以进行 10 次阳性对照实验。 6. 转化效率的计算。 取 0.1 ng 的

15、pUC19 Plasmid DNA 加入至 100 l 的热转化感受态细胞中后，再加入 900 l 的 SOC 培养基（0.1 ng DNA/ml） ，将上述培养液稀释 10 倍后（0.01 ng DNA/ml）取 100 l 涂布平板（0.001 ng DNA/100 l） ，记录菌落数。以得到 200 个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2105 cfu/ng=2108 cfu/g pUC19 DNA。 使用注意使用注意 1. Solution I 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段 DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段） 、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 l。当要转化的 DNA 量较大或准 备进行电转化时， 需对连接液进行乙醇沉淀， 纯化 DNA 后再进行转化。 进行乙醇沉淀时使用 Dr. GenTLE Precipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高 DNA 的回收率。 4. 连接反应请在 25以下进行，温度升高（26）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时，可适当延