第八章药物制剂的微生物学检查

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1、第八章 药物制剂的 微生物学检查,科学出版社卫生职业教育出版分社,【学习目标】,1.掌握药物的体外抗菌试验方法，了解药物的体内抗菌试验。 2.掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法和原理，熟悉特殊药品的无菌检查方法。 3.掌握非灭菌药物的细菌、霉菌和酵母菌计数方法，熟悉药品的大肠埃希菌检查方法。 4.了解一般药品的大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的检查方法。,科学出版社卫生职业教育出版分社,第一节 药物的抗菌试验,药物的抗菌试验目的是为了检查药物的抗菌能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。 一般先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。,科学出版社卫生职业教育出版分社,一、药物的体外抗菌试验

2、,(一)体外抑菌试验 1.连续稀释法 用于测定药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC), MIC是指药物能抑制细菌生长的最低浓度，以g/ml或U/ml表示，数值愈小，药物的抑菌作用愈强。,科学出版社卫生职业教育出版分社,（1）液体培养基稀释法：,在试管中用液体培养基进行2倍系列稀释药物，使其终浓度（g/ml）为512、256、128、64、等 在每管中加定量的试验菌液（5105cfu/ml） 2448h培养观察结果，以能抑制试验菌生长的最低浓度为该药的MIC。 如何判断抑菌还是杀菌？,科学出版社卫生职业教育出版分社,液体培养基稀释法测定药物

3、的最小抑菌浓度(MIC),科学出版社卫生职业教育出版分社,液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）通过平板培养证实,科学出版社卫生职业教育出版分社,（2）固体培养基稀释法：,1）平板法： 方法：将不同浓度的药液按19混入尚未凝固的琼脂培养基中（厚度34mm） 制作成含有递减浓度药物的琼脂平板将定量的菌液（0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍） 点种法逐个点种于平板（要进行阴性对照） 培养 测得各种细菌对药物的MIC（g/ml）。 应用：测定多种细菌对同一药物的MIC； 各种药物的抗菌活性测定； 新抗菌药物的筛选。 优点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。,科学出版社卫生职业教育出版分社,2）

4、斜面法：,方法：将不同递减浓度的药液混入未凝固的装有琼脂培养基的试管中制成斜面接种定量的试验菌液培养测知MIC （g/ml）。 应用：适用于必须较长时间培养的试验菌(如结核杆菌)或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。,科学出版社卫生职业教育出版分社,2.琼脂扩散法,原理：是利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长，形成无菌生长的透明圈即为抑菌环。抑菌环的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系（抑菌环越大， MIC 越小）。 方法：在琼脂平板上接种（涂布法或倾注法）试验菌加药于平板上培养1824h观察测量抑菌环直径，或抑菌范围的大小评价药物抗菌作用的强

5、弱。 应用： 用于定性试验； 初步判断药物的抗菌作用的大小。 缺点：精确度较差、干扰因素较多。,科学出版社卫生职业教育出版分社,（1）滤纸片法：,方法：无菌滤纸片蘸取一定浓度的抗菌药物放置 于含菌平板表面。 将预先配制含药的干纸片贴在接种细菌的 平板表面。 国际标准K-B法（Kirby-Bauer法）： 水解酪蛋白(Mueller-Hinton，MH)培养基； 被测细菌的浓度、纸片的质量、纸片含药量； 其他试验条件。 以卡尺精确量取抑菌环的直径大小， 判断该菌对该药物的 耐药 （resistant,R）、 中介（intermediate,I） 敏感（susceptible,S）,科学出版社卫生

6、职业教育出版分社,K-B法抑菌试验,显 示 抑 菌 圈,科学出版社卫生职业教育出版分社,优点：在1个平板上测定多种药物对同一试验菌的抗菌作用 应用：新药的初筛试验，以初步判断新药是否具有抗菌作用 病原菌的药物敏感试验，供医生选用药物时参考 药敏试验结果解释： “耐药”（R）：即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效； “中介”（I）：提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效； “敏感”（S）：即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制。,科学出版社卫生职业教育出版分社,方法：是在无菌平板上挖直

7、沟，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌，经培养后观察细菌的生长情况，根据沟和细菌间抑菌距离的长短来判断药物的抗菌能力。 应用：测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。,（2）挖沟法：,科学出版社卫生职业教育出版分社,(二)体外杀菌试验,1.最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration MBC）的测定 方法：按液体培养基稀释法操作测出药物的MIC，将未长菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后以无菌生长的最低药物浓度为该药物的MBC，也可称为最小致死浓度（minimal lethal concentration,MLC）。,科学出版社卫生职业教育出版分社,

8、2.活菌计数法,方法：将一定量的试验菌加入到一定浓度的药物中， 培养一定时间后取样稀释， 取一定的稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数或菌落形成单位（colony forming unit , CFU）。 方法：用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后计菌落数。 计算每毫升活菌数：菌落数或CFU乘以稀释倍数，再除以稀释液用量。,科学出版社卫生职业教育出版分社,(三) 联合抗菌试验,临床应用 治疗混合性感染； 预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生； 联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量； 联合用药比单一用药时效果更好。,科学出版社卫生职业教育

9、出版分社,联合抗菌试验的常用方法有： 棋盘稀释法和琼脂扩散纸片法 1.棋盘稀释法 定义：是由两种抗菌药物的不同稀释度加以组合，每一种药物浓度都有单独管和与另一种药物不同浓度的联合管，因其排列呈棋盘状而得名。 特点：能精确地测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。,科学出版社卫生职业教育出版分社,抗菌药物联合应用的4种结果：,协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用 的总和； 相加作用，两种药物联合应用时的活性等于两药 单独抗菌活性之和； 无关作用，两种药物联合作用的活性等于其 单独活性； 拮抗作用，两种药物联合作用显著低于其单独 抗菌活性。,科学出版社卫生职业教育出版分社,2.

10、琼脂扩散纸片法,方法：将两种含药纸片贴于已涂布试验菌的MH琼脂平板表面，两纸片之间的距离以34mm为宜，培养24h后观察结果。 结果观察：由于两种抗菌药物的联合作用，对细菌可产生不同的抑菌结果，而显示各种图形，可按不同图形报告甲、乙两药联合时对待测菌产生协同、相加、无关或拮抗作用。 含药纸片的周围出现抑菌环或无抑菌环，分别代表单独药物的敏感或耐药；两种纸片之间的变化代表两种药物的联合作用。,科学出版社卫生职业教育出版分社,协 同 作 用,拮 抗 作 用,科学出版社卫生职业教育出版分社,二、药物的体内抗菌试验,抗菌药物进入体内后，其作用的发挥受体内各种因素的影响。药物在体内与体液结合可降低药物的

11、活性或被破坏；某些药物在体内可因降解而增强活性；有些细菌进入体内后，由于代谢活力的改变，对药物的敏感性可能降低等。因此，体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有效后，才能应用于临床。,科学出版社卫生职业教育出版分社,三、影响抗菌试验的因素,1.试验菌 2.培养基 3.抗菌药物 4.对照试验,科学出版社卫生职业教育出版分社,第二节 灭菌制剂的无菌检查,各种注射剂、眼用及外伤用制剂、植入剂、可吸收的止血剂、手术用敷料、医疗器具等，必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会引起严重的事故。因此，这类制剂在出厂前都必须进行无菌检验。,科学出版社卫生职业教育出版分社,一、无菌检验的基本原则,1

12、.严格进行无菌操作 2.正确采集样品,科学出版社卫生职业教育出版分社,二、无菌检验的基本方法,（一）一般药物及物品的无菌检验 直接接种法 液体被检品可直接接种于培养基内。固体粉末或冻干制剂，需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。无菌敷料，则以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取100mg或1cm3cm的样品，分别接种于适量培养基中。供试品为放射性药品，接种量和培养基量均减半。,科学出版社卫生职业教育出版分社,（二） 油剂药物的无菌检验,因油剂药物与培养基不混溶，漂浮于培养基表面而影响菌的生长。因此这类药物做无菌检验时，应在培养基中加入表面活性剂（如吐温-80），使药物均匀分布于培养基中

13、，以利于微生物的检出。,科学出版社卫生职业教育出版分社,（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验,这两类药物在进行无菌检验前必须采用某些方法使抗菌药或防腐剂去除或失效，才能不影响对被检药物的无菌检验结果。常用的方法有 ： 1灭活法 2微孔滤膜过滤法 3离子交换树脂法 4稀释法,科学出版社卫生职业教育出版分社,三、无菌检验的结果判断,阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 1.若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定； 2.若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。,科学出版社

14、卫生职业教育出版分社,三、无菌检验的结果判断,当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求； （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素； （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确认是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,科学出版社卫生职业教育出版分社,第三节 药物的微生物限度检查,药物的微生物限度检查，是指非规定灭菌制剂及其原料、辅料受到微生物污染程度的一种检查

15、方法，包括染菌量及控制菌的检查。,科学出版社卫生职业教育出版分社,一、微生物限度检查的基本原则,1. 药物取样应有一定的数量 2.药物在检验前应保持原包装状态，不得开启，以免污染 3.检验操作应在严格的无菌条件下进行 4.为排除药物中所含防腐剂或抑菌成分对试验结果的干扰，应在被检药物的稀释液中，加入定量（约50100个）的已知阳性对照菌，然后按检验方法进行操作 5.细菌总数、霉菌总数、酵母菌总数及控制菌四项均符合该品种微生物限度检查项目规定的，应判供试品合格；其中任何一项不符合者，则判供试品不合格,科学出版社卫生职业教育出版分社,二、 细菌总数的测定,细菌总数的测定方法采用的是营养琼脂倾注平皿

16、计数法 为了防止菌落连成片状而影响计数，可在培养基中加入0.001的2，3，5氯化三苯四氮唑(TTC)，在此培养基上形成的菌落呈粉红色，便于计数。,科学出版社卫生职业教育出版分社,三、 霉菌（酵母菌）总数的测定,测定方法与细菌总数的测定方法基本相同，但培养基是采用适合霉菌（酵母菌）生长的玫瑰红钠琼脂培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基） 为了避免细菌的干扰，可在培养基中加入适当的抗细菌抗生素，如新霉素、青霉素、链霉素等以控制细菌的生长。,科学出版社卫生职业教育出版分社,四、控制菌的检验,按照制剂类型的不同，要求不得在药品中检出某些特定病原菌,科学出版社卫生职业教育出版分社,（一）大肠埃希菌的检查,检验程序 1.增菌培养 2.分离培养 3.纯培养 4生化反应,科学出版社卫生职业教育出版分社,（一）大肠埃希菌的检查,结果报告 完全符合以下结果：革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖发酵产酸产气，或产酸不产气；IMViC试验反应为+-。应判定为检出大