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1、2019/10/16,1,医学分子生物学,盛德乔,2019/10/16,2,第十一章 核酸的体外扩增,2019/10/16,3,第一节 聚合酶链式反应,polymerase chain reaction PCR,2019/10/16,4,一、PCR的基本原理,PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 9097 退火 4555 延伸 72左右,2019/10/16,5,2019/10/16,6,二、PCR引物设计,一对引物，与3端互补 长度：1530个核苷酸 碱基分布随机 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 3端必须互补 5端可游离,2019/10/16
2、,7,三、模板的制备,DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,2019/10/16,8,四、PCR的基本反应,（一）、以DNA为模板的反应： 10缓冲液 10 l 4种dNTP混合物 各200 mol/L 引物 各10100 pmol 模板DNA 0.12 g Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100 l,2019/10/16,9,PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合
3、酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能,2019/10/16,10,（二）、以mRNA为模板的反应 mRNA 5 l 5 Buffer 4 l dNTP 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20u) AMV RTase 1 l(10u) Oligo(dT)1218(或下游引物) 1 l ddH2O 6l /20 l 42水浴1小时，95 水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：,2019/10/16,11,10 Buffer 5 l 25mmol/L Mg2+ 3l Taq酶 0.5 l（2.5u） 上游引物
4、 1l ddH2O 20.5l /50 l 按PCR循环参数进行 RT-PCR,2019/10/16,12,（三）PCR产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期 。（25个循环） （四）PCR反应的自动化,2019/10/16,13,五、PCR反应条件的控制,（一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 1050mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2
5、+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L,2019/10/16,14,（三）底物浓度 dNTP浓度在20200 mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,2019/10/16,15,（五）引物 引物浓度一般为0.1 0.5mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95/30 60s 退火温度和时间 4555/30 60s 延伸温度和时间 72 循环次数 2530 不超过35,2019/10/16,16,六、PCR中应注意的事项,PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非
6、特异扩增带,2019/10/16,17,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,注意的事项：,2019/10/16,18,七、PCR技术的主要类型, 筑巢PCR 彩色PCR 多重PCR 原位PCR 不对称PCR 定量PCR 共享引物PCR 差异显示PCR 锚定PCR 重组PCR,2019/10/16,19,PCR反应的特点,特异性强： 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=-6)水平
7、 简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,2019/10/16,20,4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,2019/10/16,21,第二节 连接酶链反应,Ligase chain reaction LCR,2019/10/16,22,一、LCR的基本原理,LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5磷酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的循环反应。,2019/10/16,23,
8、2019/10/16,24,二、LCR产物的检测,标记引物： 放射性标记 荧光素标记 地高辛标记,2019/10/16,25,三、影响LCR的重要因素, 引物 基因的突变位点 长度足够 LCR的反应条件,2019/10/16,26,第三节 RNA的体外扩增 RNAPCR,2019/10/16,27,转录依赖的扩增系统(transcript-based amplification system, TAS) 自主维持序列扩增或再生式序列复制（self-sustained sequence replication,3SR) 核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based am
9、plification, NASBA）,2019/10/16,28,一、基本原理,以RNA为模板在体外大量扩增RNA 非循环相 逆转录 转录 循环相 聚合酶链式反应 反应体系温度均一 RNA产物以10的指数方式增加,2019/10/16,29,2019/10/16,30,酶： 逆转录酶，RNase H, T7RNA聚合酶 引物： 引物A与RNA3端互补，5 端含启动子 引物B与cDNA第一条链3端互补 底物：dNTP, NTP 模板： 缓冲液：,RNAPCR反应体系的组成,2019/10/16,31,二 、产物的检测 三、RNAPCR技术的特点及应用 特点： 扩增效率极高 特异性强 应用： 检测RNA，RNA测序，临床诊断,
