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1、大 肠 菌 群 及 检 验一 、 大 肠 菌 群 介 绍 大 肠 菌 群 并 非 细 菌 学 分 类 命 名 ， 而 是 卫 生 细 菌 领 域 的 用 语 ， 它 不 代表 某 一 个 或 某 一 属 细 菌 ， 而 指 的 是 具 有 某 些 特 性 的 一 组 与 粪 便 污 染 有关 的 细 菌 ， 这 些 细 菌 在 生 化 及 血 清 学 方 面 并 非 完 全 一 致 ， 其 定 义 为 ：需 氧 及 兼 性 厌 氧 、 在 37 能 分 解 乳 糖 产 酸 产 气 的 革 兰 氏 阴 性 无 芽 胞杆 菌 。 一 般 认 为 该 菌 群 细 菌 可 包 括 大 肠 埃 希 氏
2、菌 、 柠 檬 酸 杆 菌 、 产 气克 雷 白 氏 菌 和 阴 沟 肠 杆 菌 等 。 大 肠 菌 群 分 布 较 广 ， 在 温 血 动 物粪 便 和 自 然 界 广 泛 存 在 。 调 查 研 究 表 明 ， 大 肠 菌 群 细 菌 多 存 在 于 温 血动 物 粪 便 、 人 类 经 常 活 动 的 场 所 以 及 有 粪 便 污 染 的 地 方 ， 人 、 畜 粪 便对 外 界 环 境 的 污 染 是 大 肠 菌 群 在 自 然 界 存 在 的 主 要 原 因 。 粪 便 中 多 以典 型 大 肠 杆 菌 为 主 ， 而 外 界 环 境 中 则 以 大 肠 菌 群 其 他 型 别 较
3、 多 。 大 肠 菌 群 是 作 为 粪 便 污 染 指 标 菌 提 出 来 的 ， 主 要 是 以 该 菌 群 的 检 出 情况 来 表 示 食 品 中 有 否 粪 便 污 染 。 大 肠 菌 群 数 的 高 低 ， 表 明 了 粪 便 污 染的 程 度 ， 也 反 映 了 对 人 体 健 康 危 害 性 的 大 小 。 粪 便 是 人 类 肠 道 排 泄 物 ，其 中 有 健 康 人 粪 便 ， 也 有 肠 道 患 者 或 带 菌 者 的 粪 便 ， 所 以 粪 便 内 除 一般 正 常 细 菌 外 ， 同 时 也 会 有 一 些 肠 道 致 病 菌 存 在 （ 如 沙 门 氏 菌 、 志
4、 贺氏 菌 等 ） ， 因 而 食 品 中 有 粪 便 污 染 ， 则 可 以 推 测 该 食 品 中 存 在 着 肠 道致 病 菌 污 染 的 可 能 性 ， 潜 伏 着 食 物 中 毒 和 流 行 病 的 威 胁 ， 必 须 看 作 对人 体 健 康 具 有 潜 在 的 危 险 性 。 大 肠 菌 群 是 评 价 食 品 卫 生 质 量 的重 要 指 标 之 一 ， 目 前 已 被 国 内 外 广 泛 应 用 于 食 品 卫 生 工作 中 。 二 、 大 肠 菌 群 检 验 方 法 ： 由 于 大 肠 菌 群 指 的 是 具 有 某 些 特 性的 一 组 与 粪 便 污 染 有 关 的 细
5、 菌 ， 即 ： 需 氧 及 兼 性 厌 氧 、 在 37 能分 解 乳 糖 产 酸 产 气 的 革 兰 氏 阴 性 无 芽 胞 杆 菌 。 因 此 大 肠 菌 群 的 检 测 一般 都 是 按 照 它 的 定 义 进 行 。 目 前 国 内 采 用 的 进 出 口 食 品 大 肠 菌群 检 测 方 法 主 要 有 国 家 标 准 和 原 国 家 商 检 局 制 订 的 行 业 标 准 。 两 个 标准 方 法 在 检 测 程 序 上 略 有 不 同 。 （ 一 ） 国 家 标 准 ： 国 家 标 准 采 用 三 步 法 ， 即 ： 乳 糖 发 酵 试 验 、 分 离 培养 和 证 实 试 验
6、 。 乳 糖 发 酵 试 验 ： 样 品 稀 释 后 ， 选 择 三 个 稀 释 度 ，每 个 稀 释 度 接 种 三 管 乳 糖 胆 盐 发 酵 管 。 361 培 养 482h， 观察 是 否 产 气 。 分 离 培 养 ： 将 产 气 发 酵 管 培 养 物 转 种 于 伊 红 美 蓝琼 脂 平 板 上 ， 361 培 养 18-24h， 观 察 菌 落 形 态 。 证 实 试验 ： 挑 取 平 板 上 的 可 疑 菌 落 ， 进 行 革 兰 氏 染 色 观 察 。 同 时 接 种 乳 糖 发酵 管 361 培 养 242h， 观 察 产 气 情 况 。 报 告 ： 根 据 证 实为 大
7、 肠 杆 菌 阳 性 的 管 数 ， 查 MPN 表 ， 报 告 每 100ml（ g） 大 肠 菌 群的 MPN 值 。 具 体 操 作 参 见 GB4789.3-94 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 食 品卫 生 微 生 物 学 检 验 大 肠 菌 群 测 定 （ 2） 原 国 家 商 检 局 制 订 的 行 业 标 准 ， 等 效 采 用 美 国 FDA 的 标 准方 法 ， 用 于 对 出 口 食 品 中 的 大 肠 杆 菌 进 行 检 测 。 本 方 法 采 用 两 步 法 ： 推 测 试 验 ： 样 品 稀 释 后 ， 选 择 三 个 稀 释 度 ， 每 个 稀 释 度
8、 接 种 三 管 LST 肉汤 。 361 培 养 482h， 观 察 是 否 产 气 。 证 实 试 验 ： 将 产气 管 培 养 物 接 种 煌 绿 乳 糖 胆 盐 （ BGLB） 肉 汤 管 中 ， 361 培 养482h， 观 察 是 否 产 气 。 以 BGLB 产 气 为 阳 性 。 查 MPN 表 ， 报 告 每ml(g)样 品 中 大 肠 菌 群 的 MPN 值 。 具 体 操 作 参 见 SN0169-92 中 华 人 民 共 和 国 进 出 口 商 品 检 验 行 业 标 准 出 口 食 品 中 大 肠 菌 群 、粪 大 肠 菌 群 和 大 肠 杆 菌 检 验 方 法 三
9、、 说 明 ： 1 MPN 检 索 表 ： MPN 为 最 大 可 能 数 (Most Probable Number)的 简 称 。 这 种 方 法 ， 对 样 品 进 行 连 续 系 列 进 行 稀 释 ， 加 入 培 养基 进 行 培 养 ， 从 规 定 的 反 应 呈 阳 性 管 数 的 出 现 率 ， 用 概 率 论 来 推 算 样品 中 菌 数 最 近 似 的 数 值 。 MPN 检 索 表 只 给 了 三 个 稀 释 度 ， 如 改用 不 同 的 稀 释 度 ， 则 表 内 数 字 应 相 应 降 低 或 增 加 10 倍 。 注 意 国 家标 准 和 行 业 标 准 中 所 附
10、 MPN 表 所 用 稀 释 度 是 不 同 的 ， 而 且 结 果 报 告单 位 也不 相 同 。 2 初 发 酵 和 证 实 试 验 ： 无 论 是 国 家 标 准 的 三 步 法 还 是 行 业 标准 的 两 步 法 ， 都 利 用 了 乳 糖 发 酵 管 进 行 了 两 次 发 酵 试 验 ， 培 养 基 的 配制 略 有 不 同 ， 但 都 是 为 了 证 实 培 养 物 是 否 符 合 大 肠 菌 群 的 定 义 ， 即“在 37 分 解 乳 糖 产 酸 产 气 ”。 初 发 酵 阳 性 管 ， 不 能 肯 定 就是 大 肠 菌 群 细 菌 ， 经 过 证 实 试 验 后 ， 有
11、时 可 能 成 为 阴 性 。 有 数 据 表 明 ，食 品 中 大 肠 菌 群 检 验 步 骤 的 符 合 率 ， 初 发 酵 与 证 实 试 验 相 差 较 大 。 因此 ， 在 实 际 检 测 工 作 中 ， 证 实 试 验 是 必 需 的 。 3 产 气 量 与 倒 管 ：在 乳 糖 发 酵 试 验 工 作 中 ， 经 常 可 以 看 到 在 发 酵 倒 管 内 极 微 少 的 气泡 （ 有 时 比 小 米 粒 还 小 ） ， 有 时 可 以 遇 到 在 初 发 酵 时 产 酸 或 沿 管 壁有 缓 缓 上 浮 的 小 气 泡 。 实 验 表 明 ， 大 肠 菌 群 的 产 气 量 ，
12、 多 者 可 以 使 发酵 倒 管 全 部 充 满 气 体 ， 少 者 可 以 产 生 比 小 米 粒 还 小 的 气 泡 。 如 果 对 产酸 但 未 产 气 的 乳 糖 发 酵 如 有 疑 问 时 ， 可 以 用 手 轻 轻 打 动 试 管 ， 如 有 气泡 沿 管 壁 上 浮 ， 即 应 考 虑 可 能 有 气 体 产 生 ， 而 应 作 进 一 步 试 验 。 4 挑 选 菌 落 ： 国 家 标 准 中 ， 需 要 对 初 发 酵 阳 性 培 养 物 接 种 伊 红美 蓝 平 板 分 离 ， 对 典 型 和 可 疑 菌 落 进 行 观 察 和 证 实 试 验 。 由 于 大 肠 菌群
13、是 一 群 细 菌 的 总 称 ， 在 平 板 大 肠 菌 群 菌 落 的 色 泽 、 形 态 等 方 面 较 大肠 菌 更 为 复 杂 和 多 样 ， 而 且 与 大 肠 菌 群 的 检 出 率 密 切 相 关 。 国 家 标 准方 法 规 定 伊 红 美 蓝 平 板 为 分 离 培 养 基 ， 在 该 平 板 上 ， 大 肠 菌 群 菌 落 呈黑 紫 色 有 光 泽 或 无 光 泽 时 ， 检 出 率 最 高 ；红 色 、 粉 红 色 菌 落 检 出 率 较 低 。 另 外 ， 挑 取 菌 落 数 与 大 肠 菌群 的 检 出 率 有 密 切 关 系 ， 只 挑 取 一 个 菌 落 ， 由
14、 于 机 率 问 题 ， 尤 其 当 菌落 不 典 型 时 ， 很 难 避 免 假 阴 性 的 出 现 。 所 以 挑 菌 落 一 定 要 挑 取 典 型 菌落 ， 如 无 典 型 菌 落 则 应 多 挑 几 个 ， 以 免 出 现 假 阴 性 。 5 抑 菌剂 ： 大 肠 菌 群 检 验 中 常 用 的 抑 菌 剂 有 胆 盐 、 十 二 烷 基 硫 酸 钠 、 洗衣 粉 、 煌 绿 、 龙 胆 紫 、 孔 雀 绿 等 。 抑 菌 剂 的 主 要 作 用 是 抑 制 其 它 杂 菌 ，特 别 是 革 兰 氏 阳 性 菌 的 生 长 。 国 家 标 准 中 乳 糖 胆 盐 发 酵 管 利 用胆
15、 盐 作 为 抑 菌 剂 ， 行 业 标 准 中 LST 肉 汤 利 用 十 二 烷 基 硫 酸 钠 作 为 抑菌 剂 ， BGLB 肉 汤 利 用 煌 绿 和 胆 盐 作 为 抑 菌 剂 。 抑 菌 剂 虽 可 抑制 样 品 中 的 一 些 杂 菌 ， 而 有 利 于 大 肠 菌 群 细 菌 的 生 长 和 挑 选 ， 但 对 大肠 菌 群 中 的 某 些 菌 株 有 时 也 产 生 一 些 抑 制 作 用 。 有 些 抑 菌 剂 用 量 甚 微 ，称 量 时 稍 有 误 差 ， 即 可 对 抑 菌 作 用 产 生 影 响 ， 因 此 抑 菌 剂 的 添 加 应 严格 按 照 标 准 方 法 进 行 。
