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1、举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组 DNA 序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其
2、他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。一、生物物理学方法1. 融合蛋白 pull-down 实验融合蛋白 pull-down 技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如 Sepharose） ，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件
3、而回收下来。为了更有效地利用 pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988 年 Smith 等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出 GST 融合蛋白。从此 GST 融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST 融合蛋白在经过固定有 GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过 GST 与 GSH 的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST 融合蛋白 pull-
4、down 方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白 A 融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有 IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合 Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。2. 亲和印迹亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的
5、是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。3. 免疫共沉淀如果在非变性的条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持，所以就可利用免疫共沉淀方法找出相互作用的蛋白质。这其中的例子包括 Harlow 等。利用抗体沉淀腺病毒的 EIA 蛋白时发现了真核细胞中有与 EIA 蛋白特异结合的蛋白质；McMahon 等利用该方法确定了转录结构域相关蛋白质可以与 E2F1 和 c-Myc 转录因子相互作用的蛋白质。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通
6、过蛋白质 A 或蛋白质 G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用 SDS-PAGE 鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。4. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术的原理是：处于激活状态的供体，可以将其本身的荧光传递到与之十分邻近（通常在 10 nm 之内）的受体上。因此，如果用遗传突变的绿色荧光蛋白（GFP）或是合成的荧光染料标记蛋白质，则可以通过荧光体之间的能量传递来确定两蛋白质的相互作用。这种方法较之上述的方法有两个优点：（1 ）蛋白质之间的相互作用是发生在完整细胞
7、里，比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。（2 ）利用这种方法，可以观察到蛋白质在细胞内的定位。二、分子生物学方法1. 噬菌体展示技术噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。2. 酵母双杂交1989 年 Field 等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母的生长转录因子 GAL4 含有的两个结构域， DNA 结合域（DNA binding domain， BD）及转
8、录激活域（DNA activating domain，AD） ，将已知基因（诱饵基因）和靶基因或含有靶基因的 cDNA 分别构建在含 BD及 AD 质粒载体上，当这两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若 BD 结合的诱饵蛋白能够与AD 结合的靶蛋白或文库中某些 cDNA 编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的 BD 与 AD 在空间上接近，呈现 GAL4 转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如His 及 LacZ 等基因的表达，从而在特定的缺陷培养基上生长。因此，利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研究已知蛋白间的相互作用。利用酵母双杂交技术筛选 cDNA 文
9、库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白间的相互作用，一般首先考虑的问题是诱饵载体的构建。编码诱饵蛋白的基因经酶切处理后，按照正确的读码框与诱饵载体如 pGBTK7 相连接，再经酶切或测序做进一步的验证分析。构建好诱饵载体还要同时转化诱饵蛋白酵母菌株如 Y187 和靶蛋白酵母菌株如 AH109，进行毒性和自激活性检测，证明诱饵蛋白的表达对酵母正常生长没有毒性，同时也不能自身激活酵母报告基因的表达，可用于筛选文库或研究蛋白间的相互作用。第二个要考虑的问题就是靶蛋白载体或酵母双杂 cDNA 文库的构建。一般在编码靶蛋白的基因或 cDNA 两端加上同源重组序列，然后与靶蛋白载体如pGADT72Rec
10、 共同转化靶蛋白酵母菌株如 AH109，在酵母同源重组酶的作用下，靶蛋白基因或 cDNA 序列整合到载体上，完成靶蛋白载体或 cDNA 文库的构建。最后一步就是筛选文库或直接研究两个蛋白间的相互作用。分别含有诱饵蛋白载体和靶蛋白载体的酵母杂交后，在酵母体内融合表达 BD 诱饵和 AD 靶蛋白。诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用，导致位于侧翼的 BD 与 AD 在空间上接近，呈现GAL4 转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如 His 及 LacZ 等基因的表达，根据报告基因的表达情况，从而达到分离蛋白或研究蛋白互作的目的。三、遗传学技术合成致死筛选合成致死效应是指两个基因同时发生突变时会产生致死效应
11、，而当每个基因单独发生突变时，则无致死效应。这总遗传学方法可以用于分析两个育幼相同重要功能的蛋白之间的相互作用。由于合成致死突变株是不能存活的，不能直接得到致死菌株，因此，在实验室中多使用条件突变菌株。如温度敏感菌株是可以在某些温度条件下致死的突变型。合成致死筛选所得到的两种相互作用蛋白可能是同一复合物的两种组分或是一种蛋白对另一种蛋白所有的调节作用。四、展望蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用
12、，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。依赖基因序列来分析蛋白质相互作用的分析方法正在形成。而这些先进的、简易的、大规模分析蛋白质相互作用的技术发展又推动了蛋白质组学的进步。可以预见在不久的将来，随着基因组研究和蛋白质组学的不断深入，生命科学中的种种疑难将被逐一攻破。蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用，我个人认为可能可以从六个角度理解：蛋白质-蛋白质的相互作用，蛋白质-DNA 的相互作用，蛋白质-RNA 的相互作用，从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，研究具体的基因的功能，蛋白质在相互作用过程中的结构改变或重折叠或者去折叠。下面分别简单叙述一下。蛋白质-蛋白质的相互
13、作用研究技术：酵母双杂交，免疫共沉淀，蛋白质-蛋白质共结晶后X-ray diffraction,NMR,pull-down，质谱（ESI-MS 可以用检测蛋白质 -蛋白质的相互作用） ，荧光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-蛋白质的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-蛋白质的相互作用位点，低温冷冻电镜观测等，光镊技术目前尚在研究开发阶段。蛋白质之间的相互作用如果不是直接相互作用，也可以通过蛋白质-RNA 的相互作用和蛋白质-DNA 的相互作用而间接产
14、生。蛋白质-DNA 的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，CHIP,DNA-蛋白质共结晶后 X-ray diffraction,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM) ，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-DNA 的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/ 去折叠对蛋白质-DNA 的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-DNA 的相互作用的特异作用位点的化学交联等。蛋白质-RNA 的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，RNA-蛋白质共结晶后 X-ray diffraction（核
15、糖体大小亚基的晶体结构就是这样测定的） ,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-RNA 的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-RNA 的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-RNA 的相互作用的特异作用位点的化学交联等。另外，可以从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，比如可以模拟与预测生物大分子相互作用前后的结构变化推测计算出具体的相互作用位点和构象和能量变化等，生物大分子相互作用在细胞中构成复杂的网络-比如
16、小世界网络，等级网络，scale-free 网络等，可以应用系统生物学的和图论的方法探测出细胞在基因表达的某些方面的相互作用分子体系构成的网络，然后根据网络的抽象的一般特征去研究有关分子间的可能的作用机理和网络整体运行机制。研究具体的基因的功能也是研究基因表达相互作用的方法。具体我不谈了，我只强调一点：除了基因敲除或敲入，应用蛋白质（比如抗体）亲和作用在细胞内抑制功能蛋白质的功能等降低基因功能的方法外，增强基因功能或者基因异位表达也是研究基因功能的重要方法，非常突出的是 iPS cell。产生诱导多能干细胞的方法It(iPS cell) is now possible to reprogram mouse and human somatic cells to a pluripotent state by ectopic expression of the factors OC T4, SOX2, KLF4and c-MYC or a different set of four factors (OCT4, SOX2, NANO
