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1、Comment MSOffice1: 射线的穿透力比较弱,主要引起皮肤的放射损伤(2cm左右),作为临床颅内肿瘤的放疗, 射线是否是首先值得商榷,建议该为电子线.青蒿琥酯增加人脑胶质瘤细胞 CHG-5对 射线的敏感性董俊清 1，赵妍妍 1，姚琦 1，蒋为薇 1，李军 1，李斌 1，庞学利 2，周红 1, *第三军医大学( 1药学院药理教研室 : 董俊清，赵妍妍，姚琦，蒋为薇，李军，李斌，周红；2西南医院放疗中心: 庞学利) ,重庆 400038摘要 目的：检测青蒿素（artemisinin，ART） 、双氢青蒿素（dihydroartemisinin ，DHA） 、青蒿琥酯（artesunat
2、e，AS ）对两株胶质瘤细胞 CHG-5及 U87的细胞毒性，从中筛选出联合 射线，对这两株胶质瘤细胞均有放射增敏作用的药物，并观察其在体外实验中对肿瘤放射敏感性的影响，并初步探讨放射增敏的机制。方法：首先, 我们采用 MTT法测定上述青蒿素衍生物对两株胶质瘤细胞的 IC50，并观察以 20% IC50浓度的青蒿素衍生物联合 射线对 CHG-5及 U87的放射增敏效果，从中筛选出放射增敏效果最好的药物；然后通过克隆形成法计算目标药物的放射增敏比；划痕法观察它对 射线照射后 CHG-5细胞迁移的影响；检测胞内还原型 GSH水平；最后，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布情况。结果：ART、DHA
3、、AS 对 CHG-5的 IC50分别为：1.47mM、0.20mM 、0.29mM ；对 U87MG，则分别为 1.61mM、0.25mM、0.46mM。以 20% IC50为 射线的协同给药浓度，仅有 AS可以同时抑制经 射线照射后的 CHG-5及U87细胞的增殖。且 0.06 mM的 AS对 CHG-5细胞的放射增敏比为 1.25，该浓度的 AS可以明显地抑制 CHG-5细胞的迁移。 GSH结果表明 0.06mM AS处理组较未处理组细胞内 GSH水平下调（ P0.05） ，流式细胞术结果提示 0.06mM AS可以阻滞细胞周期于 G1期。结论：我们从三种 ART衍生物中筛选出 AS对
4、CHG-5细胞具有放射增敏作用，机制可能与下调的胞内 GSH水平及细胞周期阻滞于 G1期有关。关键词: 脑胶质瘤；青蒿素；衍生物； IC50；放射增敏Artesunate enhances the radiosentivity of human glioma cell line CHG-5 to-ray【第一作者简介】董俊清，男，湖北安陆（县或市？）人,医师，主要从事肿瘤放射增敏剂青蒿琥酯的研究。Tel:86-23-68752265 E-mail:【通讯作者简介】周红，女，江苏南京人，博士后，教授，博士生导师，主要从事感染、炎症的发病机制及其防治措施的研究工作。Tel :+86-023-687
5、52266E-mail :Abstract Objective: To assay the cytotoxicity of artemisinin(ART), dihydroartemisinin(DHA) and artesunate(AS) to two glioma cell lines CHG-5 and U87. We selected a compound which had radiosensitization on both cell lines when synergied with -ray. Also, we observed the radiosentivity in
6、vitro and investigated the mechanism preliminarily. Methods: First, we employed MTT to assay the IC50s of two cell lines to ART and its derivatives. When synergized with-ray, we observed the radiosensitization of drugs with 20% IC50 and selected the optimal one. Subsequently, sensitivity enhancement
7、 ratio(SER) was determined by colony-forming assay. Scratch test was used to observe the effect of objective drug on cell migration. Then, intracellular reduced GSH was measured. Finally, flow cytometry was employed to assay the cell apoptosis and cell cycle distribution. Results: For CHG-5, the IC5
8、0 of ART, DHA and AS was 1.47mM, 0.20mM and 0.29mM, respectively. Correspondingly, the IC50 for U87 was 1.61mM, 0.25mM and 0.46mM, respectively. Only AS could suppress the proliferation of both cell lines under the concentration of 20% IC50 when combined with-ray. Furthermore，the SER of 0.06 mM AS f
9、or CHG-5 was 1.25. Meanwhile, 0.06 mM AS could significantly inhibit the cell migration. Compared with medium group, down-regulated GSH production was found after the treatment of 0.06 mM AS（ P0.05）. Flow cytometry suggested the cell cycle was arrested in G1 phase by 0.06 mM AS. Conclusion: In prese
10、nt study， we found AS enhanced the radiosentivity of human glioma cell line CHG-5 to-ray from three artemisinin derivatives, which was associated with decreased intracelluar GSH and G1 arrest. Key words: glioma; artemisinin; derivatives; IC50; radiosensitization人脑胶质瘤是头颈部常发的恶性肿瘤，尽管目前有多种方式进行的加强治疗，如最大范
11、围的手术切除、放疗、化疗等，但往往患者的平均死亡时间都较短。采用放射增敏剂增强对胶质瘤的放疗效果成为优化胶质瘤放疗的一个新途径，从传统的中草药中的有效成分筛选出低毒、高效的放射增敏剂一直是一个研究热点。本实验室前期发现 AS 对肺癌细胞A549 具有较好的放射增敏作用。基于此，本研究拟从青蒿素及其常见的衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯中筛选出对两株胶质瘤细胞具有较好放射增敏效果的药物，并初步探讨其Comment MSOffice2: 细胞的代数Comment MSOffice3: 技术方法的描述应简单明瞭,需精简.Comment MSOffice4: 题目是 青蒿琥酯对胶质瘤的敏感性研究,建议此部分
12、内容及相应的结果省略.Comment MSOffice5: 请写出目标药物的具体名称放射增敏的机制，以期为青蒿素及其衍生物联合放射治疗在临床治疗脑胶质瘤中的应用提供一定的实验依据。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 细胞株 脑胶质瘤细胞株 CHG-5及 U87由第三军医大学第一附属医院病理研究所卞修武教授惠赠。1.1.2 试剂 高糖型 DMEM购于 Gibco公司；10%胎牛血清购于 PAA公司；噻唑兰（MTT ）购于 AMERISU公司；二甲基亚砜（ DMSO）购于成都市科龙试剂化工厂；ART粉剂出自重庆酉阳县涪陵山制药有限公司；DHA 粉剂由重庆华立武陵山制药有限公司提供。AS 粉针剂
13、出自桂林南药股份有限公司。ART 与 DHA均溶于 DMSO配成实验所需浓度。GSH 测定试剂盒，南京建成生物工程研究所出品。1.2 方法1.2.1 ART、DHA、AS 对 CHG-5及 U87细胞增殖的影响 CHG-5细胞采用含 10%胎牛血清的 DMEM培养液，于 37 、5%CO2 的培养箱中进行传代培养。取对数生长期的细胞，按 1.0104/孔接种于 96孔的培养板，每孔接种细胞悬液 180L，再在每孔加入 20L的不同浓度的 ART稀释液。每组设 5个复孔，并以不加药的单纯细胞培养组为空白对照组，置入孵箱继续培养 48h；于每孔加入 20L 新鲜配制的 MTT溶液，培养 4h，弃上
14、清，加入 150LDMSO 置于摇床中以 100rpm振摇 10min后，于 490nm处测定吸光度OD490。根据抑制率计算公式：抑制率=（1给药组 OD490均值/空白对照组 OD490均值）100% ，计算出每个给药浓度下细胞的抑制率，结合其给药浓度，采用 Logit法计算药物对细胞的 IC50。1.2.2 具有放射增敏药物的筛选 以 20% IC50的药物浓度处理给药组及处理联合组作用 24h后给予单纯放射组及联合组 6MeV 5Gy 射线（医用 2300C/D型直线加速器，美国VARIAN公司） ，再过 24h，终止培养，余步骤同 1.2.1。1.2.3目标药物对 CHG-5细胞集落
15、形成的影响 将处于对数生长期的细胞，按每皿100、300、600 、1200、2400 、4800 个，共分 6各组，分别接种于直径为 60mm的培养皿中，每种接种方式均有 6个平皿，每皿 5mL，其中三个平皿的目标药物浓度为 20% IC50，为实验组；另外三个平皿不加药，设为对照组。37培养 24h后，6 个组的全部平皿分别按组划分接受 6MeV 的 电子射线 0、2、4、6、8、10Gy 的辐射，照射后继续于 37孵育培养 10d，中途更换培养液一次。培养结束后，弃培养液，PBS 洗涤、甲醇固定后Giemsa 染色后计数，含 50 个细胞以上的定义为一个集落（光镜下辅助计数） ，细胞贴壁
16、率（plating efficiency，PE ）及存活率（surviving fraction ，SF）计算公式如下：PE（% ）=对照组集落数/ 细胞种植数100%SF（%） =实验组集落数/细胞种植数PE得出细胞分别在加药与不加药两种情况下分别在 0、 、2、4、6、8、10Gy 照射情况下存活率，采用 SigmaPlot v11.1 软件运用放射增敏的多靶单击公式：S=1-（1-e -D/D0） n拟合细胞的存活曲线图，其中 S 为存活分数， D 为放射剂量（Gy） ，D 0为平均致死剂量，Dq 为准阈剂量，n 为外推数。并计算 SER（sensitivity enhancement ratio，增敏比）=未加药单独放射组 D0 值/加药联合放射组 D0 值。1.2.4 目标药物对 CHG-5 细胞迁移的影响 调整细胞接种浓度为 2.
