dna化学合成的应用

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1、中国试剂网 3.9.15 DNA 化学合成的应用 随着 DNA 合成技术的发展， 特别是自动化合成技术的引入， 人们能简便、 快速、 高效地合成其感兴趣的 DNA 片段。 目前， DNA 合成技术已成为分子生物学研究 必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日 益发挥重要的作用。 1. DNA 合成在基因工程和分子生物学研究中的应用 1.1 合成基因 目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明， 人们已经可以 根据需要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。 已报道的合成基 因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素 II、集落刺激因

2、 子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。我国上 海生物化学研究所等单位于 19841 年首次在世界上合成了具有生物学活性的酵 母丙氨酸转移核糖核酸，为人类文明作出了应用的贡献。 目前，合成基因的方式有 2 种。全基因合成：一般对于分子较小而又不易 得到的基因采用该方式。可将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成 基在在 100 个核苷酸以上时)，每个片段长度控制在 4060 个碱基，并使每对相 邻互补的片段之间有6 个碱基交叉重叠。在体外将除基因两端末端外的所有片 段磷酸化。混合退火后加入 DNA 连接酶，即可得到较大的基因片段。如果需连 接亚克隆的方法，最后将

3、亚克隆的较大片段重组为完整的基因。采用分步连接、 亚克隆的方法时，为便于亚克隆中回收基因片段。应在片段两侧设计合适的酶切 位点，由于每个亚克隆可以分别鉴定，从而可减少顺序错误的可能性。酶促合 成：此法又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂 贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而利于普及使用。首先合成末端之间有 1014 个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在 4 种 dNTP 存在的条件下，通过 DNA 聚合酶 I 大片段(Klenow 酶)或反转录酶的作用，获得 两条完整的互补双链。在合成基因的结构中，应包括有克隆和表达所需要的全部 信号及 DNA 顺序

4、，基因密码的阅读框架也应该同表达体系相适应。此外，由于 不同种类的生物体或密码子的使用都具有明显的选择性， 在基因合成和克隆时必 须考虑这个问题。选择合适的密码子，以获得高效表达。 中国试剂网 3.9.15 1.2 合成探针 基因的克隆和分离已成为现代分子生物这研究必不可少的手段。DNA 合成 技术在其中起着越来越重要的作用。 它不仅使得过去颇费周折的基因筛选与鉴定 成为常规技术， 而且使得克隆载体的构建及克隆基因和载体的连接变得更加容易 和准确。蛋白质的结构可以通过 mRNA 的结构间接地得出。相反，如果已知某 个肽段的氨基酸顺序，也可根据密码简并的原则推导出所有可能的 mRNA 序列 密码

5、。人工合成的具有特定顺序的寡聚 DNA 片段，已应用于筛选和鉴定重组质 粒或 噬菌体。实验证明用合成的寡核苷酸片段，即使只有 1 对碱基错配采用严 谨条件杂交也能与完全互补的双链相区别。因此，使用作探针的寡核苷酸，应将 密码的简并度调至最高限度时，可减少假阳性，增加筛选的准确率。 1.3 合成引物 1.合成 PCR 引物进行基因扩增：PCR 技术是 80 年代中期发展起来的一种体 外扩增特异 DNA 片段的技术。该法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百 万特异 DNA 序列拷贝。PCR 技术的特异性取决于所用引物和模板 DNA 结合的 特异性。合成引物在 PCR 反应中的使用。 2.序列测定

6、用引物：DNA 序列测定是分子生物学中最重要和最精细的研究 技术，其中最常使用的是末端终止法，即是一种依赖于特异 DNA 引物的序列测 定方法，此外该法对模板的需要量较大，这就要求待测 DNA 片段尤其是拷贝数 少的片段首先克隆到适合的载体中经过扩增后进行序列测定。 常用的克隆载体如 M13、pUC19、PBR322 等均可购到有商品出售的公用测序引物。 3.合成导入突变用的引物：利用寡核苷酸引导的突变，可在目的 DNA 序列的任 何部分产生点突变、插入和缺失，从而使得基因编码的蛋白质在结构和功能上发 生改变。 1.4 合成连接子和接头 在 DNA 重组中常需要将外源 DNA 片段插入某些载体

7、 DNA 中。 如果载体或 外源 DNA 上没有合适的限制性内切酶位点，为提高插入效率或实现定向克隆， 可采用合成连接子(linker)和接头(adaptor)的方法。使用连接子和接头需要插入片 段是平末端，否则，首先需要用 DNA 聚合酶 I 大片段补齐或者用核酸酶 S1 或 Bal31 处理得到平末端后才可同连接子或接头连接。 中国试剂网 3.9.15 具有多酶切点的接头(polylinker)还广泛应用于构建某些运载体， 使之带有多 个新的酶切位点。 这在质粒 pUC 系列及用于序列分析的 M13mp 噬菌体系统中都 得到了广泛的应用。接头片段带用来调整表达载体的读码框架，用于基因表达及

8、 功能的研究。 合成基因在医学中的应用 随着科学技术的发展， 人们对疾病的认识已逐步从整体和器官的水平深入到 细胞分子水平。医学家发现，许多严重危害人类健康的疾病，如遗传性疾病、肿 瘤、心血管疾病等可在基因结构上找到某些变化，如基因的缺失、突变、转位或 致病左因的存在，以此作为证据亦可对这些疾病作同相应的判断。例如镰刀状细 胞贫血症即是由于 AT 突变造成 -珠蛋白第六位谷氨酸变为缬氨酸， 从而造成 珠蛋白结构异常，并引起红细胞形态及对氧的亲合力发生改变。通过人工合成的 19 个核苷酸作为探针即可明确区别正常人、 杂合和纯合的病人。 目前， 合成 DNA 探针已广应用于临床，成为一种有效的诊断

9、手段。 .1 用于遗传病的诊断 过去仅有少数遗传性疾病可以凭借蛋白质和酶学方面的异常作出判断， 随着 分子生物这的发展，对遗传病的诊断有了巨大的进步，出现了基因诊断法。医学 上使用基因诊断法最早成功的报道是1985年Saiki等人对镰刀状红细胞贫血的诊 断。另外，对于以突变为主的 -地中海贫血，以合成 DNA 片段为探针，亦可得 同满意的结果。 .2 用于传染病的诊断 临床上对传染性疾病的传统诊断程序常常是检浊病原体及其抗体，需时较 长，达不到早期诊断的目的。合成探针在传染病特别是由病毒感染性所致的传染 病检测中，已得到广泛应用，尤其是结合 PCR 方法使诊断的灵敏度可进一步提 高，目前国内已

10、制出检测乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、轮状病毒和疱疹疾病等 多种基因探针诊断试剂盒。 人工合成核酸在医学上不仅可以作为一种手段， 而且在某些疾病的治疗上显 露了端倪寡聚核苷酸及其衍生物对肿瘤的治疗已经取得可喜的进展。 作为蛋白质 翻译抑制剂的寡核苷酸现称为反义 RNA 或反义 DNA。 其作用原理可能有以下几 种：反义 RNA 与体内靶 mRNA 结合形成双螺旋，使 mRNA 不能成为翻译蛋 中国试剂网 3.9.15 白质的模板。反义 RNA(DNA)与 DNA 结合。影响 DNA 复制。反义 RNA 能阻止 mRNA 与核蛋白体结合，降低蛋白质合成效率。 反义 RNA 或反义 DNA 最近年来国际上研究课题的热点，人们寄希望它在 抗病毒，尤其是对艾滋病和肿瘤基因治疗上发挥重要，为征服这两类严重威胁人 类健康的疾病作出贡献。