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1、Section 4 Editing, processing and recognition of oligosacchrides in glycoconjugates,一. 生物体内糖链的合成及加工 二. 生物体内糖链的降解 三. 生物体对糖链信息的识别 四. 糖相关基因与糖组,一. 生物体内糖链的合成及加工,糖链的生物合成是受到基因控制的，基因编码特定的糖基转移酶，控制糖复合物中寡糖链的合成。 通常一种酶负责一种糖苷键的生成（少数例外），但同一种糖苷键可能由多种酶（同工酶）催化。 糖基化（glycosylation)：在酶的催化下，糖链接到肽链的过程。非酶催化的糖链接到肽链的过程称为糖化（g
2、lycation）。 糖基化的场所是分泌途径中的内质网和高尔基体。N-糖链开始于内质网，与蛋白合成同时进行，但在高尔基体内可被进一步修饰；O-糖链的合成则主要是在高尔基体内。,1. N-糖链的合成和加工过程：,N-糖链的合成分为几个阶段，不同阶段在不同的场所进行 第一步：在脂质载体（多萜醇焦磷酸,dolichol, Dol）上合成一个14个糖的共同前体G寡糖。 G寡糖 = 五糖核心+6个Man+3个Glc 五糖核心结构（2GlcNAC+3Man）： Man16(Man 1 3)- Man1 4- GlcNAc1 4 GlcNAc 1O-P-P-Dol 多萜醇的结构：,核苷糖是糖链合成的前体：
3、寡糖链合成的底物是核苷二磷酸或单磷酸糖，内质网和高尔基体膜上含有核苷糖的转运蛋白，可以将在胞浆中合成的核苷糖转运到内质网和高尔基体腔内。 不同的糖基转移均有专门的糖基转移酶催化，它们大多是位于内质网膜和高尔基体内的膜蛋白。,a,糖蛋白核心寡糖链（G寡糖）的合成,G-寡糖,第二步： 在内质网中，糖基由长萜醇基-二磷酸寡糖-蛋白质糖基转移酶（dolichyl-diphosphooilosaccharide-protein glycosyltransferase, or oligosaccharyltransferase, OST）催化复合体催化，将糖基从长萜醇上整体转移到蛋白质Asn-X-Ser/
4、Thr结构中的Asn上，形成N-寡糖连接。 OST定位于内质网膜上的膜腔一侧，并与新生肽链转移通道系统相结合，从而将糖基化与蛋白合成和跨膜相偶联。,人类OST至少由6个亚单位构成： 核糖体亲和蛋白I和II（ribophorin I and II）； OST48； 抗细胞凋亡蛋白（defender against apoptotic cell death，DAD1）；STT3-A/STT3-B；N33-1/N33-2/IAP OST在不同组织可形成多种同形物，同形物比例不同，可导致潜在N- 糖基化位点上实际糖基化的比例不同。 OST的催化亚单位是STT3-A或STT3-B，负责催化G寡糖的整体转
5、移。G寡糖中核心5糖之外最后添加的3个Glc是整体寡糖链合成完毕，可以整体转移的识别信号。 作用机制高度保守，普遍存在于所有真核细胞和一些古细菌中。,第三步：在ER中由葡萄糖苷酶催化，将G寡糖非还原末端的3个葡萄糖切除；还将切除一个特定的甘露糖基。 同时肽链折叠。,肽链折叠过程中，糖链对蛋白质折叠起到监控作用： 钙连素（calnexin)和钙网素（calreticulin）分别是位于内质网上和游离于内质网腔的凝集素，两者还有分子伴侣的功能，识别配体：Glc1Man79GlcNAc2-Asn-R（是折叠尚未完成或蛋白刚合成的寡糖链标志），可协调蛋白质的多种正常折叠。 M型凝集素（M-type l
6、ectin）:主要为EDME,能够识别：Man8GlcNAc2-Asn-R（是蛋白质错误折叠且无法纠正的标识），并将蛋白反向运出内质网，进入细胞质泛肽降解体系。 L型凝集素（L-type lectin）： 人体中的ERGIC-53（ER-Golgi intermediate compartment 53）和VIP36可识别：Man59GlcNAc2-Asn-R（是内质网糖蛋白已经折叠良好，需要运送至高尔基体进一步加工的标志）。,第四步： 肽链折叠完成后，被以非笼形蛋白包被的内质网囊泡形式，专一性转移到高尔基体进行进一步的加工。 一种小的GTP结合蛋白家族Rab家族引导囊泡从ER到达高尔基体以及
7、高尔基体的不同部位。 高尔基体的不同部位含有不同的酶，因此催化内容不同： 近侧高尔基体（cis)：复杂型糖链在此被切除5个Man （高Man糖型寡糖链因蛋白特定构象不进行此反应） 中部高尔基体（medial）：连接GlcNAc和L-Fuc 远侧高尔基体（tran)：加上最外侧的Gal和Sia,糖蛋白的加工始于内质网，完成于高尔基体； 糖链的加工是多样化的，相同肽链有时也表现出糖基的微小差异，是由于糖基化不完全或糖基转移酶专一性差异造成的,2. O-糖链的合成和加工过程：,O-糖链的形成一般认为在N糖链之后，也是在酶的催化下逐一连接上去的，有的在ER，有的ER-高尔基体之间，还有的在内侧高尔基体
8、，但主要是在高尔基体内进行。 类型和催化的关键酶：,3. GPI糖基脂锚钩的合成：,蛋白质的GPI化包括两步反应：一是蛋白质前体和GPI锚钩的各自合成，第二步通过一个转肽过程实现蛋白质的GPI化。 3.1 GPI脂锚钩的合成： GPI锚钩的合成与一般糖链合成相似，是在一个糖基受体上逐一接上不同的糖残基： 肌醇磷脂（PI，磷脂基抛锚于ER膜内）接受UDP活化的 GlcNAc，随后脱去乙酰基，留下PI-氨基Glc； 后者接受Dol-P-Man提供的3个Man，形成PI-GlcNH2-(Man)3，最后接受磷脂酰乙醇胺提供的磷酸乙醇胺基，作为与蛋白质C-端氨基酸羧基连接的桥梁。,3.2 蛋白质GPI
9、化： GPI化蛋白质的C-端一般含有约30个氨基酸序列，是蛋白质GPI化的信号序列，该序列一般有一段疏水序列是GPI化所必须的，可形成螺旋结构插入ER膜中，固定已合成的蛋白分子。该序列将在转肽时被切除。 与GPI直接结合的那个氨基酸被称为氨基酸，一般是Ala、 Asp、Asn、Gly、Ser等较小的氨基酸。,3.3 蛋白质GPI化的转肽过程： 蛋白质GPI的转肽过程是由糖基磷脂酰肌醇转酰胺酶复合体催化的。 该复合体位于ER，含有5个亚单位，即GAA1、PIG-A（或GPI 8）、PIG-B（或PIG-S）、PIG-T、PIG-U。其中GPI 8为催化亚基；PIG-U与底物GPI的识别有关。 该
10、复合体能够识别在肽链的羧端带有GPI信号序列的I型跨膜蛋白（指氨基端位于细胞膜外表面或细胞器腔面的跨膜蛋白），切断氨基酸之后的信号序列，并将肽段转移到合成的GPI锚钩的磷脂酰乙醇胺的氨基上。 GPI锚钩的核心是保守的，但整体结构是多样化的：末端的两条脂肪酸链种类可以不同，且可长可短；GPI锚钩的核心中的三个Man均可以结合多种形式的糖基侧链。,4. 进入溶酶体蛋白糖信号的合成：,4.1 分拣信号Man-6-P的合成： 溶酶体蛋白质 绝大多数为水解酶类，因此它们的分拣信号明显区别于其它蛋白，采用的是特殊的糖信号Man-6-P。 内质网中糖蛋白上的糖链接受通用的后加工，进入处于内质网和高尔基体之间
11、的中间区室，糖链中特定的Man残基在酶的催化下，接上GlcNAc-1-P，接着切除另一个Man后，在再接上一个GlcNAc-1-P，随后切除这两个GlcNAc，留下磷酸基，即产生了分拣信号Man-6-P。,4.2 信号受体及其循环： 高尔基体膜的腔面一侧存在着6-P-甘露糖的结合蛋白受体，也称为P型动物凝集素，能够特异结合N-寡糖末端带有6个磷酸甘露糖的标记的溶酶体蛋白，并与其形成复合物。 然后，复合物从高尔基体上出芽并被引入笼形蛋白包被的囊泡中（所谓早期内吞体），后者很快除去笼形蛋白后与晚期内吞体结合，内部PH降为5.5，导致复合物解体，磷酸化的酶与其受体分离。 晚期内吞体分裂为小的转运体，
12、溶酶体酶失去磷酸基并被运送到溶酶体；而P-selectin（受体）被送回高尔基体循环使用。 此外质膜表面也存在6-P-甘露糖的受体，用于收回胞外的溶酶体酶，以免造成细胞结构损伤。,新合成的溶酶体酶在细胞内的加工和转送研究提供了一个极有意义的例证： 一些糖蛋白上的糖链和蛋白质表现的一些生物活性并无直接关系，而这些糖链却对这些糖蛋白在何处起作用至关重要。因此可说，糖链是一个调节因子，它们对蛋白质的活性起到了空间上的调节作用。例如，虽然糖链和溶酶体酶的酶活力无关，然而，糖链起到了空间调节、定位作用，使这些酶仅在溶酶体中有活性。,Structure of the bovine mannose 6-ph
13、osphate receptor complexed with Man- 6-P (PDB ID 1M6P). Man- 6-P is hydrogen-bonded to Arg111 and coordinated with the manganese ion (green). The His105 hydrogen-bonded to a phosphate oxygen of mannose 6-phosphate may be the residue that, when protonated at low pH, causes the receptor to release Man
14、- 6-P into the lysosome.,P-selectin,二. 生物体内糖链的降解,糖链的降解受到多种糖苷酶的催化，包括内切和外切酶。 早期的研究主要集中于各种外切糖苷酶，因其基因缺陷可引起多种溶酶体积累病。 近年才克隆了一些重要的内切糖苷酶(endouglycosidase)基因，在人体内，内切糖苷酶在细胞迁移运动、发育分化、感染、炎症、癌变和胞外基质重塑等生理和病理过程中起着关键作用。 以下是几种受到高度关注的糖苷内切酶：,1. 糖酰胺酶（glycoamidase，EC 3.5.1.52 ） 也称多肽：N-寡糖酶（petide: N-glycase, PNGase)，它可与E
15、R特有膜蛋白derlin结合而附着在ER的胞质侧，能够专一性水解错误折叠的蛋白质中N-寡糖与Asn之间的酰胺键，使N-寡糖以完整形式从蛋白的Asn上被切割下来，而Asn转变为Asp。 PNGase高度保守，普遍存在于从酵母到人类的所有真核细胞中，具有不可替代的生物学作用。 功能：偶联泛肽-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome sytem,UPS）参与内质网蛋白质折叠的质量控制，是内质网相关降解途径（ER-associated degradation, ERAD）的关键部分。,内质网相关降解途径（ERAD）的主要过程是： （1）内质网中错误折叠的蛋白质，或者亚单位组装不正常的蛋
16、白质可被标记上特定的糖链：Man8GlcNAc2-Asn-R（这是蛋白质错误折叠且无法纠正的标识） （2）该结构可被ER中的M型凝集素EDME等识别和检出，并通过内质网上的反向移位器（retrotranslocon）或脱位器（dislocon）将蛋白反向运出ER，进入细胞质。 （3）随后被泛肽降解体系加上泛肽标记，附着在ER胞质侧的PNGase 将庞大的N-糖链切除，消除空间障碍后，蛋白准备进入“垃圾桶”蛋白酶体降解。 （4）PNGase可在人类DNA修复蛋白HR23B（酵母中为Rad23同源分子）的中介下与泛肽体系中的蛋白酶体结合（结合部位是蛋白酶体的19S亚单位S4），形成PNGase- HR23B-S4复合物。,2. 几丁质酶（chitinase） 人类几丁质酶兼具几丁质内切糖苷酶和转糖基化酶的活性，除水解几丁质中的GlcNAc 之间的14糖苷键之外，还可将切下的几丁质寡糖整体转移到其它糖苷非还原性末端的GlcNAc上。可能与免疫防御及过敏反应有关。 人类几丁质酶有两种：在巨噬细胞
