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1、多肽组技术与应用魏开华北京蛋白质组研究中心主要内容1. 背景介绍2. 多肽组样品制备3. 非原位多肽组研究4. 原位多肽组研究5. 应用示例多肽组（peptidome）是指活体生物器官、组织、细胞和体液中的全部内源性多肽组份。多肽组学就是研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系的学科。多肽组学和蛋白质组学都是基因组学的补充，多肽组学填补了蛋白质组学与代谢组学(metabonomics)之间的“间隙（gap）”。标准的蛋白质组研究策略不适合多肽组研究，因为它们不能覆盖到较小的分子量区域。 Peptidomics多肽组的生物来源：1. 动物体液：血、乳汁、脑脊液、胃液、尿液、精液、唾液、毒囊（
2、如蜂毒、蝎毒、蜘蛛毒）等2. 动物组织：肝、脾、肾、血管、肠、海马、表皮、睾丸、卵巢、子宫、眼球等3. 某些植物：花粉、果汁、海藻等血清包含蛋白质和小分子多肽、盐、类脂、氨基酸和糖等，数量达百万种，其中水90%91%,蛋白质6.5%8.5%和多肽2%左右。 多肽组研究1. 多肽组样品制备2. 非原位多肽组研究（血清多肽组）3. 原位多肽组研究（质谱成像）血清处理的结果范例：SDS-PAGE血清处理的结果范例-MSZipTip是一种末端带有约0.6L层析介质的10L吸管尖，因此不会出现死体积。它是质谱分析之前快速（数秒种）浓缩、脱盐和分馏多肽、蛋白质或寡核苷酸的好工具。这种装置结构简单，使用方便
3、。使用时，将其置于一个单管或多管的移液器、标准的22格钝端的HPLC针、或自动的液体操作/样品制备的工作站上。为了吸附样品，通过介质反复抽、吸几次。此时，污染物也以同样的方式被清洗掉。然后将浓缩、纯化后的样品用1-4L相容的溶剂精确地洗脱，直接转移到质谱仪或小瓶中。对于那些要求较小洗脱量的应用（例如小于1L），可用仅含0.2L介质的微量规格。特 点1.可纯化及浓缩fmolepmole的生物样本。样本需要少。 2.可以避免清去污剂和其他缓冲盐等对质谱分析的准确性及重現性的影响3.分离填料置于微量吸管(pipette tip)內操作方便 常用树脂种类及其应用C18去除peptide，protein
4、或oligonucleotides样本内的盐类及浓缩样品，增加MALDI-TOF MS的灵敏度及解析度C4蛋白质去盐及浓缩SCX去除样品中的清洁剂，浓缩含有机溶液的多肽常用种类及规格ZipTip脱盐通用步骤（1）用50%ACN 中性溶液活化Millipore C18 ZipTip. 吸排510次。（2）用0.1% 甲酸溶液平衡C18 ZipTip。吸排除510次。（3）用2 ul 0.1% 甲酸溶解酶切产物，用C18 ZipTip 吸附肽段。吸排510次。（4）用0.1% 甲酸溶液洗盐。吸排除23次。（5）用4 ul 含0.1% 甲酸的50%ACN溶液洗脱肽段供质谱分析。2 ul/次，吸排2次
5、。金属亲和ZipTip磷肽处理步骤不要有高浓度有机溶剂金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（1）0.1% acetic acid or 0.01% formic acid with 10% acetonitrile金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（2）金属亲和ZipTip磷肽处理步骤（3）效果比较多肽组研究的主要方向1. 非原位多肽组研究（血清多肽组）2. 原位多肽组研究（质谱成像）典型的多肽组技术：非原位MALDI-TOF-MS，LC-ESI-MS, Q-FT-MS 分析ESI-CID, MALDI-TOF/TOF, MSn 测序生物信息学软件分析、建模，早期诊断多肽制备的核心问题一：重复性同一
6、例样品连续3天检测的重复性比较方法可靠性研究Normalized Peak Intensity Comparison样本保存时间的比较(-80 )洗脱液的优化FT-MS和MALDI-TOF-MS对样品处理要求差异很大点靶条件的优化样品和基质的比例不同样品处理方法的比较不同人员处理的比较稀释效应 提问与解答：蛋白组样品制备为什么不建议在后期进行浓缩和稀释？ 沉淀、溶解度、高级结构、离子强度、pH、动态范围、低丰度蛋白。等电聚焦。多肽组可以进行适当的浓缩和稀释？ 3D displayClinProTools ClassificationBioMarker ？m/z1460.847 sequence
7、多肽组研究的主要方向1. 非原位多肽组研究（血清多肽组）2. 原位多肽组研究（质谱成像）经典的标志物研究思路潜在的问题n 提取完全吗？组成偏好吗？n 成分有化学变化吗？n 能真正代表活样本的成分吗？能否用原位分析方法进行生物标志物的研究？原位多肽组学主要是指:1. 直接分析器官、组织或细胞的多肽组。2. 仅简单处理器官、组织或细胞后分析他们的多肽组。质谱法原位多肽组研究的基本思路主要特点v 可获得组织中多肽等化合物的空间分布和相对丰度等信息。v 它不局限于特异的一种或几种多肽分子，不需要事先对研究分子进行染色或标记，具有高通量等特点。v 本技术无需将组织中的多肽等分子提取出来。v 本技术可“快
8、速、直观、准确”确定药物是否到达预期作用的部位，这对于筛选高效药物是至关重要的。1997年，Caprioli等人首次提出了质谱扫描生物组织切片成像技术，主要针对大鼠脑、海马、附睾组织的研究。已有多个报道找到标志物并用于诊断研究！2003年初，我们与布鲁克公司联合开发MALDI质谱成像技术，并制定了相关技术策略、方法和标准。IMS与MRI诊断结果比较（一）实验脑肿瘤大鼠(Charles River Laboratories)MRI仪器：7T magnet (Varian)测量指标：T1(纵向弛豫时间)T2(横向弛豫时间)ADC（表观弥散系数）IMS与MRI诊断结果比较（二）IMS与MRI诊断结果
9、比较（三）基本方法探索主要研究内容1 MALDI直接扫描组织切片的基本方法2 正交试验优化系统3 基质溶剂中不同有机相的优化4 基质溶剂中TFA浓度的优化5 方法重复性的考察6 组织贮存稳定期的考察7 像构建，成像结果分析，多肽分布规律8 质谱组织成像定位准确性验证技术路线Autoflex TOF/TOF Ultra III TOF-TOF分析软件FlexControl FlexAnalysisFlexImagingClinProtSimica组织平均谱：自编Hits统计软件：自编MS2DPlot ：自编基质制备是关键之一基质覆盖方法新型喷雾装置覆盖基质的共结晶效果 压电高频震动喷雾法喷雾颗粒
10、均匀，肝脏有特征性声波基质微粒喷涂器Acoustic Reagent Multispotter (ARM)CHIP-1000 Chemical Printer图像质量与激光密切相关1. L9（34）正交优选试验质谱图像图像分布类型具有明显的组织依赖性Hits值分布分析与质谱图像分类有关Hits：指分子在切片的全部质谱图中命中的次数。我们自编软件自动统计所有质荷比分子的Hits值，根据Hits的大小，可以自动对这些质谱图像进行区域划分为：分布面积大于80%，50%左右，低于20%等不同分布类型。应用示例高功率微波损伤效应研究n 电磁辐射长期暴露引起健康危害。n 高功率微波产生极其明显的非热效应。
11、n 海马是微波辐射的敏感靶部位。n HPM模拟辐射源, 构建微波损伤效应模型 。n 采用质谱扫描成像技术分析。n 比较模型组和对照组SD大鼠海马的多肽、蛋白组分差异 。n 鉴定差异组分。病理学分析 H&E200模型组大鼠海马组织水肿、疏松，血管扩张；神经元胞体变小，可见核深染的神经元，胞核呈三角形、梭形和菱形等改变，严重可见坏死；锥体细胞减少； 质谱成像图分类根据对上千张质谱成像图的人工观察，提出依据组分分布面积来进行质谱成像图分类的方案，共分成了5种类型。 其中，互补型为特征分布。差异统计分析结果差异分子共计199个，其中上调194个，下调5个。所有差异分子分子量均小于6000Da。分子量在
12、10002000Da之间的差异分子有95个，均为上调；分子量在2000-6000Da之间的差异分子有104个。 MALDI-TOF/TOF-MS 鉴定差异分子 n 鉴定结果： 共鉴定出蛋白18个。根据蛋白功能分类，经鉴定的差异蛋白主要涉及细胞骨架、能量代谢、生物合成、突触传递、信号转导、应激等功能。 蛋白质分类及功能n 神经胶质酸性蛋白，正常生理条件下表达于星形胶质细胞中，可视为星形胶质细胞的标志物。n 髓磷脂碱性蛋白是构成髓鞘的主要蛋白质，当神经系统受到损伤，机体游离的MBP将明显升高。在本实验研究中，它们的降解组分，一些小分子多肽的量表现为增加。n 以上两个蛋白的变化提示海马组织结构可能发
13、生了损伤，细胞可能受到了破坏。n 谷氨酸(Glu)是快速突触传递所必需的兴奋性递质。谷氨酰胺合成酶(GS)是Glu代谢的关键酶。GS作为谷氨酸谷氨酰胺循环的重要成分,能将Glu转化为谷氨酰胺,从而解除Glu对神经元的兴奋毒性作用。 n GS的表达上调，推测机体可能通过加强Glu代谢，抑制Glu蓄积引起的过度兴奋，从而对神经元起到代偿性保护作用。超高分辨质谱成像最新MALDI-FT：离子连续累积CASI 大大地消除了化学背景，显著提高了信噪比，是质谱成像技术的一次飞跃奥氮平（olanzapine）在肾脏中的分布 奥氮平（olanzapine）剂量确定 每日剂量须根据临床状况而定，范围在每日5毫克至20毫克之间。推荐起始剂量和常规治疗剂量为每日10毫克。维持剂量应为最小有效剂量，一般亦为10毫克，但应定期评估。超过每日15毫克的用药，应进行临床评估。超过每日15毫克的用药，应进行临床评估，预防严重肾功能损害或中度肝功能损害。奥氮平（olanzapine）在肾脏中的分布 奥氮平（olanzapine）在肾脏中的分布 UltraFT Imaging:不是神话胜似神话 (2-hr olanzapine dose)发挥ClinProtTool优势，对图像数据进行统计分析提取坐标导入xmlPCA分析PCA分析:偏差统计
