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1、DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸。(!)变性（模板DN
2、A解旋）模板DNA经加热至90以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。(2)复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。(3)延伸DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。循环数变性复性延伸第一次（预变性）94C，30s30次94，20s52，20s72，20s最后一次（保温）72，30s(2)琼脂糖凝胶电泳DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相
3、关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。三、实验仪器及试剂7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电
4、泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸四、实验步骤1、DNA体外扩增(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。(2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分：10x Buffer50 LMgCl250 LdNTP mixture20L上游引物(引物I)25L下游引物(引物II)25 L模板DNA25 LddH2O290L原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul
5、,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）(3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然
6、后冷却至60 ，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入1x电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。（5）将80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸荧光染料中，按1:1比例混合。（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul样品于另一0.5ml的离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加1ul的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取10ul缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口，以防
7、止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V，电流最大。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。（8）取出凝胶块，在DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。3、紫外分光光度计检测DNA含量（1）最后1组取2ulPCR反应液，加入98ul蒸馏水，将样品稀释50倍。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）根据下面的公式计算DNA含量：DNA含量（ul/ml）=50*（260nm的
8、读数）x稀释倍数 五、注意事项 1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达16000r/min，如果这时打开离心机上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。另外，离心管一定要对称放置。 2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到80V，大大超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。 简答题 1. 氨基酸脱氨后产生的氨和-酮酸有哪些主要的去路？ 答：氨基酸经脱氨基后所生成的氨进入血液，由丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输，大部分在肝中合成尿素，只有少部分在肾以铵盐形式由尿排出。氨基酸经脱氨基后所生成的-酮酸可
9、以进一步代谢，主要有三条代谢途径。 （1）经氨基化生成非必需氨基酸：哺乳类动物体内的一些非必需氨基酸一般通过-酮酸氨基化而生成。 （2）转变成糖及脂类：-酮酸可以转变为糖和脂肪。分别用各种不同的氨基酸喂养人工造成糖尿病的犬时发现，大多数氨基酸可使尿中葡萄糖的排出量增加，少数几种（异亮、苯丙、酪、苏及色氨酸）可使尿中葡萄糖和酮体的量都增加，而亮氨酸和赖氨酸只能使尿中酮体的排出量增加，因此将氨基酸分为三大类：生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸。 （3）氧化供能：-酮酸在体内可通过三羧酸循环和生物氧化体系，彻底氧化为CO2和H2O，同时释放能量供生理活动的需要。 2氨在血液中是如何转运的？ .
10、答：氨是有毒物质，各组织中产生的氨必须以无毒性的方式经血液运输到肝合成尿素或运到肾以铵盐的形式随尿排出，现已阐明，氨在血液中主要以丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输的。 （1）丙氨酸-葡萄糖循环：肌肉中的氨基酸经转氨基作用将氨基转给丙酮酸生成丙氨酸，丙氨酸经血液运到肝脏。在肝中，丙氨酸通过联合脱氨基作用，释放出氨，用于合成尿素。转氨后生成的丙酮酸经糖异生途径生成葡萄糖。葡萄糖由血液输送到肌组织，在肌组织中葡萄糖分解转变成丙酮酸，丙酮酸再接受氨基生成丙氨酸。丙氨酸和葡萄糖反复地在肌肉和肝脏之间进行氨的转运，所以将这一途径称为丙酮酸-葡萄糖循环。通过这个循环，即使肌肉中的NH3以无毒的丙氨酸形式运输到肝
11、，同时，肝又为肌肉提供了生成丙酮酸的葡萄糖。由此具有重要的生理意义。 （2）谷氨酰胺的运氨作用：谷氨酰胺是另一种转运氨的形式，它主要从脑、肌肉等组织向肝或肾运氨。氨与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下生成谷氨酰胺，并由血液运输到肝或肾，再经谷氨酰胺酶水解成谷氨酸和氨，氨在肝脏中可用于合成尿素，解除氨毒，在肾脏则与H+结合并以NH4+盐形式随尿排出。3. 试述血氨的来源和去路。答：体内氨的来源主要有三方面：氨基酸、胺类物质氧化分解产NH3；肠道吸收的NH3；肾小管上皮细胞产生的NH3。（1）氨基酸脱氨基生成的氨是体内NH3的主要来源。胺类物质氧化分解也可产生NH3。（2）由肠道吸收的NH3包括两部分
12、：氨基酸在肠道细菌作用下产生的氨尿素经肠道细菌尿素酶水解产生的氨，肠道产NH3量较多，每日约4克。（3）肾小管上皮细胞产生的NH3主要来自谷氨酰胺，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下水解成谷氨酸和NH3。这部分NH3分泌到肾小管管腔中与尿中的H+结合成NH4+,并以铵盐的形式随尿排出，对调节机体的酸碱平衡起重要作用。氨的主要去路：（1）氨主要在肝脏经尿素循环合成尿素。（2）合成谷氨酰胺（3）合成非必需氨基酸4试述尿素合成的过程和特点。.答：尿素合成的过程：（1）氨基甲酰磷酸的合成：反应在线粒体中进行。氨可与CO2可在氨基甲酰磷酸合成酶（CPS-）的催化下，合成氨基甲酰磷酸。（2）瓜氨酸的合成：反应在
13、线粒体中进行。在氨基甲酰转移酶的催化下，氨基甲酰磷酸与鸟氨酸缩合生成瓜氨酸。（3）精氨酸的合成：反应在胞液中分两步进行。首先，瓜氨酸在线粒体合成后，被转运到线粒体外。在胞液中，在精氨酸代琥珀酸合成酶催化下，瓜氨酸与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，由ATP供能。其后，精氨酸代琥珀酸再经精氨酸代琥珀酸裂解酶催化，裂解成精氨酸及延胡索酸。（4）精氨酸水解生成尿素：反应在胞液中进行。在胞液中，精氨酸受精氨酸酶的作用，水解生成尿素和鸟氨酸。鸟氨酸通过线粒体内膜载体转运再进入线粒体，并参与瓜氨酸合成。如此反复，完成尿素循环。尿素合成的特点：鸟氨酸循环先在线粒体中进行，再在胞液中进行。每进行一次循环，就能合
14、成一分子尿素，需要两分子的NH3和一分子CO2, 2分子NH3。一分子来自体内氨基酸脱氨基生成，另一个由天冬氨酸提供，而天冬氨酸又可由其它氨基酸通过转氨基生成。因此，尿素分子中的两分子NH3都是直接或间接来自于各种氨基酸。另外，每合成一分子尿素消耗3分子ATP，4 个高能磷酸键。 5. （1）何为一碳单位？写出四种体内重要的一碳单位基因。 （1）某些氨基酸在代谢过程中可以产生含有一个碳原子的基团，称为一碳单位。体内的一碳单位有：甲基（-CH3）, 亚甲基（-CH2-），次甲基（-CHO=），甲酰基（-CHO），亚氨甲基（-CH=NH）。 （2）一碳单位的辅酶是什么？又如何与之结合？ （2）四氢
15、叶酸是一碳单位的载体，即四氢叶酸是一碳单位代谢的辅酶。一碳单位通常结合在FH4分子的N5、N10位。 （3）一碳单位还要来源于哪几种氨基酸代谢？ （3）一碳单位主要来源于丝，甘，组和色氨酸的代谢。 （4）简述一碳单位的生理功能 （4）一碳单位的生理功用：作为合成嘌呤和嘧啶的原料：如：N10-CHO-FH4、N5N10-CH-FH4提供嘌呤环C2、C8的来源。N5N10-CH2-FH4提供胸苷酸的甲基来源。把氨基酸代谢和核酸代谢联系起来。药理作用：磺胺药通过干扰细菌、恶性肿瘤细胞的叶酸、四氢叶酸的合成，进一步影响一碳单位代谢与核酸合成。 6. 甲基化作用是体内重要的代谢反应，具有广泛的生理意义。哪种氨基酸可以提供甲基？其活性形式如何？又如何代谢转换，重新生成循环利用？ .答：（1）甲硫氨酸可以提高甲基分子中含有S-甲基，通过各种转甲基作用可以生成多种含甲基的重要生理活性物质。 （2）活性形式是S-腺苷甲硫氨酸，甲硫氨酸在转甲基之前，必须首先与ATP作用，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM中的甲基称为活性甲基，SAM称为活性甲硫氨酸
