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1、血卟啉衍生物光动力作用杀伤人胰腺癌细胞的实验研究作者：赵玉沛杨波张太平蔡力行朱预单位：100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院外科关键词：血卟啉衍生物；光化学疗法；胰腺肿瘤摘要：目的探讨光动力作用(PDT)对体外培养的人胰腺癌细胞的杀伤效应。 方法以 2 株人胰腺癌细胞系 P3 和 SW1990 为研究对象，采用血卟啉衍生物(HPD) 作为光敏剂，用高压钠灯（功率密度 25 mW/cm2)为光源，以系列浓度的 HPD 经不同剂量的光照后，用MTT 法测定 PDT 对胰腺癌细胞的相对抑制率。结果随光敏剂浓度的升高和照光剂量的增加，光动力作用对细胞的相对抑制率逐渐增大，在低光动
2、力剂量下明显上升，随后上升渐趋缓慢达平台期；相同光动力剂量下，PDT 对 2 株细胞的相对抑制率存在明显差异(P0.01)，LD90 剂量条件亦不同。结论光动力作用对体外培养的人胰腺癌细胞具有明确的杀伤效应，其对细胞的相对抑制率具有显著的剂量效应关系；2 株人胰腺癌细胞对PDT 的敏感性不同。Abstract：Objective To observe the effect of photodynamic therapy(PDT)on human pancreatic carcinoma cell lines in vitro. MethodsTwo lines of human pancrea
3、tic carcinoma cell P3 and SW1990 were studied to investigate the killing role of PDT with hematoporphyrin derivative(HPD) as photosensitizer and sodium lamp as light source. The cultured cells were treated with serial concentrations of HPD followed by irradiation of different dosages of visible ligh
4、t, then MTT colorometric assay was applied to measure the relative inhibitory rate of PDT for the cells.ResultsThe relative inhibitory rate of PDT for the cells elevated along with the increase in the concentration of sensitizer and dose of light. Under the low photodynamic dose, it increased rapidl
5、y, and gradually slowed down to reach the plateau. Under the same photodynamic dose, significant difference in the inhibitory rate between the two lines was observed (P0.01), and the LD90 was also different. ConclusionsPDT has a significant killing effect on human pancreatic carcinoma cell lines in
6、vitro, and its relative inhibitory rate appears to be correlated with the dose of sensitizer and light irradiation. The sensitivity of the two cell lines to PDT is different.Key words：Hematopor phyrin derivative；Photochemotherapy；Pancreatic neoplasms由于胰腺癌早期缺少特异性症状， 发现比较晚， 现有治疗方法如手术、化疗和放疗等疗效均不佳。国外自 8
7、0 年代初开始探索将光动力治疗用于胰腺癌，并进行了一些细胞和动物实验研究。我们试图在细胞水平探讨光动力治疗对体外培养的人胰腺癌细胞的作用。材料与方法一、 材料1光敏剂：血卟啉衍生物(HPD)针剂:100 mg/20ml，主要吸收峰在 320500 nm，避光保存于 4 冰箱。2光源：高压钠灯：波长 589 nm，总功率 400 W，照射实验所用的功率密度为 25 mW/cm2，照射距离为 20 cm。3细胞系：(1)P3 人胰腺癌细胞系：由北京协和医院病理科建立并提供使用。(2)SW1990 人胰腺癌细胞系:自美国引进，由中国人民解放军总医院肿瘤生物研究室提供。4主要试剂：(1)RPMI-16
8、40 培养粉：Gibco 公司产品。(2) 小牛血清：沈阳辉山生物制品厂产品，56 30 min 灭活，4 冰箱保存。(3)TE 消化液：为含 0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠的 PBS 溶液，经 0.22 m 滤膜过滤除菌，20 冰箱保存。(4)MTT3-(4,5)-双甲基-2- 噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝为 Sigma 公司产品。溶于 pH 7.4 PBS 中配成 5 mg/ml 溶液，0.22 m 滤膜过滤除菌，4 保存，2 周内使用。二、方法1细胞复苏、培养、传代和冻存：人胰腺癌细胞株 P3 和 SW1990 均为贴壁细胞。从液氮中取出冻存细胞，立即置于 40
9、水浴中，使细胞快速解冻，于含 5% CO2 和饱和湿度的 37 恒温孵箱中培养，以后 23 d 更换一次培养基，当细胞生长至 80%90% 融合时传代，用 TE 消化液制成单细胞悬液，分装继续培养或移入冻存管置于液氮罐中冻存，亦可根据实验需要对细胞进行处理。2MTT 法初筛接种 96 孔培养板的活细胞数1:MTT 为四氮唑化合物,可溶于水，进入细胞后，可被活细胞线粒体脱氢酶切断四唑环，转变成一种不溶于水的甲 化合物（formazan） ，死细胞内不会发生这种改变。甲 化合物可被异丙醇或二甲基亚砜等有机溶剂溶解，呈蓝紫色，用于吸光度测定，其 OD 值越高，说明细胞内酶的活力越大，活细胞越多。其吸
10、收谱随细胞数和 pH 值而改变。取指数生长期细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液计数后稀释成 2105/ml，将 96 孔培养板分为 8 组，每组 6 复孔，第 1 组取 200 l/孔细胞 (4104/孔) ，然后倍比稀释 6 次至625 个细胞/孔，第 8 组为单独加培养液的空白对照组。于 37 ，5%CO2 恒温孵箱中培养72 h，弃尽孔内培养液，加入 5 mg/ml 的 MTT 每孔 20 l，用新鲜培养液稀释至 200 l，37温育 4 h，弃尽培养液，加入 DMSO 150 l/孔，立即置微量振荡器上振荡 5 min 使甲 化合物充分溶解，酶标仪(=570 nm)测 OD 值。重复 3
11、 次实验取其均值,作 OD 值与接种细胞数的关系曲线，求相关系数 r，选择出适宜的细胞接种浓度。3MTT 法筛选 PDT 对 P3 和 SW1990 细胞系的作用参数:根据初筛结果，确定每孔接种的细胞数为 2104/孔，接种于 96 孔培养板，37 ，5% CO2 孵箱中培养 24 h 贴壁。将1 mg/ml HPD 贮存液用 RPMI-1640 完全培养基稀释至实验所需浓度：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 g/ml 共 10 个不同浓度。为照光方便每 96 孔板只接受同一种光剂量的照射，每种光剂量的实验重复 3 次，设以下 5 种照光剂量2、4、6、8、10 J/cm2。
12、每板均设有纯培养基空白对照组，癌细胞对照组及实验组( 不同浓度 HPD)，每组 6 复孔。于接种细胞后 24 h 后弃去旧培养基，加入含不同浓度 HPD 的完全培养基 200 l 继续培养 24 h,换新鲜 1640 完全培养基后立即经不同剂量光照后培养 72 h，MTT 法测 OD 值计算相对抑制率。统计学分析，每株细胞得到 5 条曲线，选择适宜的LD90 剂量条件。结果1MTT 法初筛接种的活细胞数：已知浓度的活细胞接种后,测定了接种活细胞数与MTT-甲 化合物 OD 值之间的关系 ,经统计学处理,细胞数在 1044104 之间时,二者呈高度正向直线相关,r=0.983（P 0.05） 。
13、因此将接种细胞数定在 1044104 个/孔为宜(图 1)。 图 1MTT 测定结果(OD570)与接种细胞数的关系2MTT 法筛选 PDT 的作用参数：2 株细胞经系列浓度的光敏剂及不同剂量的光照后，采用 MTT 法测定 MTT-甲月赞化合物的 OD 值，按如下公式计算细胞相对抑制率：参照文献2报道的相对抑制率的评价，50%为敏感,30% 50%为中度敏感,30%为不敏感(耐药)。所见 PDT 的相对抑制率(表 1，2) ，随 HPD 浓度的增加和光剂量的增大而升高,在低光动力剂量下,抑制率曲线上升迅速,后渐趋缓慢达平台期。不同 HPD 浓度和不同光剂量间差异均有极显著意义(P0.01)。对
14、 2 株细胞均表现为光剂量越大,达到平台期所需的 HPD 浓度越低 ,反之亦然。低光剂量 2 J 时,2 株细胞相对抑制率与 HPD 浓度近似直线相关。同一光动力剂量(光敏剂浓度和光剂量的乘积 )下, PDT 对 2 株细胞的相对抑制率间差异有极显著意义(P0.01)。表 1MTT 法测定不同浓度光敏剂 HPD-PDT 对人胰腺癌 P3 细胞的相对抑制率( ，%)光剂量(J)2 g/ml4 g/ml6 g/ml8 g/ml10 g/ml12 g/ml14 g/ml16 g/ml18 g/ml20 g/mlP 值*2 12.43 23.15 31.44 31.44 45.06 45.87 65.
15、15 75.85 90.11 95.46 0.00014 22.50 53.70 81.40 88.57 91.04 91.64 98.43 98.73 98.28 98.81 0.00016 38.84 82.41 90.12 92.57 95.10 96.66 98.51 97.92 97.25 97.25 0.00028 51.12 89.96 94.20 95.65 96.76 97.99 99.11 98.88 87.21 96.65 0.000610 68.93 92.66 92.99 95.48 95.93 97.63 98.19 98.31 98.19 98.19 0.0011
16、注：不同光敏剂浓度和不同光剂量组之间比较，P 值均0.01 表 2MTT 法测定不同浓度光敏剂 HPD-PDT 对人胰腺癌 SW1990 细胞的相对抑制率( ，%)光剂量(J)2 g/ml4 g/ml6 g/ml8 g/ml10 g/ml12 g/ml14 g/ml16 g/ml18 g/ml20 g/mlP 值*2 30.01 50.85 72.48 79.82 90.56 92.58 93.30 93.72 94.01 94.01 0.00014 84.07 86.23 86.17 87.90 91.11 92.65 92.41 95.37 95.42 97.07 0.00266 84.55 86.35 88.23 89.53 91.82 91.91 92.40 94.52 95.09 96.73 0.00168 89.19 91.72 94
