第四章微生物药物制造工艺

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1、生物制药工艺学 教学课件,生物工程教研室 刘静霆,第四章 微生物药物制造工艺,生物工程教研室 刘静霆,1 微生物药物概述 2 抗生素制造工艺 3 其他微生物药物,1 微生物药物概述,一、微生物药物的定义和发展 二、微生物药物的分类 三、微生物药物研发进展,1 微生物药物概述,一. 微生物药物的定义和发展 1.定义（Microbial Medicines）： 微生物在其生命活动过程中产生的生理活性物质及其衍生物，包括抗生素，酶抑制剂，免疫调节剂等一类化学物质的总称，是人类控制感染等疾病，保障身体健康，以及用来防治动、植物病害的重要化疗药物。,2、发展,（1）传统抗生素(antibiotic）:,

2、1942年，Waksman首先定义： 抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质。,1947年,1948年,1950年,1952年,1953年,1950至80，我国译为抗菌素,1980年后，抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现，超出对微生物作用范围，又改译为抗生素。,（2）半合成抗生素 （3）微生物来源的其他活性物质 酶抑制剂: 亮肽素 bestatin 免疫抑制剂：环孢菌素A 羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂,1 微生物药物概述,3、抗生素的发展方向： 加强基础理论研究和新技术的应用 选育抗性菌种和新型菌株 大力发展农业抗生素,抗生素类

3、药物 维生素类药物 氨基酸类药物 核酸类药物 酶与辅酶类药物 酶抑制剂 免疫调节剂 甾体类激素,二.微生物药物的分类,（一）抗生素类药物 1、抗生素的命名 依动植物学、菌属学名称而定青霉素、链霉素、灰黄霉素、黄连素、蒜素、鱼素等； 依族命名四环素、氯霉素等； 依地名及俗名而定创新霉素、庐山霉素、平阳霉素、井冈霉素、土霉素等。,2. 抗生素类药物的分类,生物来源 化学结构 作用对象 作用机制,1）根据生物来源分类：,（1）放线菌产生：链霉素 （2）真菌产生：青霉素 （3）细菌产生：短杆菌 （4）动植物产生：蒜素、黄连素,2）根据化学结构分类： （1）-内酰胺类抗生素 青霉素、头孢菌素、硫霉素、亚

4、胺培南,（2）氨基糖苷类抗生素 链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素,（3）大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素,（4）四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素,（5）多肽类抗生素 多粘菌素、放线菌素、杆菌肽,（6）多烯类抗生素 两性霉素、曲古霉素、制霉菌,（7）蒽环类抗生素 柔红霉素、阿霉素、正定霉素,（8）苯烃基胺类抗生素 氯霉素、甲砜氯霉素 （9）环桥类抗生素 利福霉素 （10）其他 磷霉素、创新霉素,3）根据作用对象分类： 抗G+菌：青霉素、红霉素 抗G-菌：主要有多粘菌素 抗真菌：制霉菌素、灰黄霉素、两性霉素 抗结核分枝杆菌：链霉素、新霉素、卡那霉素 抗癌：放线菌素D、博来霉素、阿

5、霉素 抗病毒：四环类抗生素、艾霉素 抗原虫：巴龙霉素、抗滴虫霉素、蒜素,4）根据作用机制分类 抑制细菌壁合成： 青霉素 影响细胞膜功能： 多烯类抗生素 抑制核酸合成： 影响DNA结构的博来霉素、丝裂霉素C及柔毛霉素等； 抑制Pr合成： 四环素、氯霉素、链霉素 抑制生物能作用： 抑制电子转移的抗霉素、抑制氧化磷酸化作用的短杆菌肽和寡霉素,根据作用机制分类,维生素B2 维生素C -胡萝卜素,（二）维生素,-胡萝卜素,（三）氨基酸,目前大部分氨基酸可用发酵法生产,（四）核酸类药物,如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等,（五） 酶与辅酶类药物,链激酶、L-天冬酰胺酶,（六）酶抑制剂,（七）免疫调节剂 （八）

6、甾体类激素,克拉维酸、洛伐他汀,三、微生物药物研发进展,1.寻找新的微生物资源 稀有放线菌 极端微生物 海洋微生物,2.新的筛选模型及手段 新药物作用靶标 微生物产物库 高通量筛选 虚拟筛选,3.组合生物合成技术的应用,酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯酰还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等功能域,4、代谢调控与基因敲除,5.基因改组（DNA Suffling）,1 微生物药物概述 2 抗生素制造工艺 3 其他微生物药物,2 抗生素制造工艺,一、-内酰胺类抗生素 二、氨基糖苷类抗生素 三、大环内酯类抗生素 四、四环素类抗生素,一般制备过程,培养发

7、酵： 发酵液预处理 固液分离,胞内产物 细胞破碎 固液分离 胞外产物 初步纯化 精制,初步纯化方法： 沉淀、吸附、萃取、超滤 精制方法： 层析、电泳、结晶,选择方法依据,1、产品性质： 化学组成、分子量、稳定性、溶解度、解离特性等 2、主要杂质属性 3、方法前后衔接要求 4、产品质量要求,一、-内酰胺类抗生素 （一）结构与性质,a 青霉烷* b 青霉烯 c 头孢烷 d 头孢烯* e单环-内酰胺 f 碳青霉烷* g 碳青霉烯* h 碳头孢烷 I 碳头孢烯 j 氧青霉烷* k 氧青霉烯 l 氧头孢烷 m 氧头孢烯 *天然产物,Site of penicillinase action. Breaka

8、ge of the - lactam ring.,STRUCTURE OF PENICILLIN,（二）、青霉素的制备,（A）、理化性质： 1、溶解性：受pH影响 游离酸：易溶于有机溶剂，难溶于水 盐：易溶于水，几乎不溶于有机溶剂 2、酸碱性：有机弱酸,3、稳定性： 温度、pH对其稳定性的影响,4降解反应,5、聚合反应 氨苄青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨苄青霉素过敏反应的主要过敏原之一。,6、过敏反应 可能为青霉烯酸、青霉噻唑酸和青霉噻唑蛋白,（B）、制备工艺,1、菌种 最早的原始菌种是点青霉菌 现用产黄青霉菌(Pen.chrysogenum) 按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。 国内青

9、霉素生产厂大都采用绿色丝状菌。,2、发酵工艺流程,丝状菌发酵工艺流程,发酵工艺要点,碳源：乳糖、葡萄糖、天然油脂 葡萄糖母液和工业用葡萄糖 氮源：玉米浆、 花生饼粉、麸质、尿素 前体：苯乙酸、苯乙酰胺 加入量0.1% 无机盐：硫、磷、钾30%、钙20%、镁41%、Fe3+6ug/ml,3、培养条件控制,菌丝生长繁殖期: 青霉素分泌期: 菌丝生长趋势减弱，间隙添加葡萄糖作碳源和间隙加入花生饼粉、尿素作氮源，并间隙加入前体，此期间球状菌pH要求6.66.9，丝状菌pH要求6.26.4， 青霉素分泌旺盛。 菌丝自溶期:,4、控制要点： 1）糖：pH上升后可开始加糖。 2）补料及添加前体：发酵液中残余

10、苯乙酰胺浓度为0.050.08%。 3）pH：主要通过加葡萄糖控制pH 4）T：种子罐培养丝状菌要求25，发酵罐培养丝状菌要求26-24 5）通气与搅拌：深层培养需通入一定量空气，并不停地搅拌以保证溶氧的浓度 6）泡沫与消沫：泡敌,5、提炼工艺流程,工业钾盐生产工艺流程,p581,影响因素 pH值：萃取到BA时，pH选2.02.5，而从BA反萃取到水相时，pH选6.87.2 温度：低温(10以下) ，在设备上要考虑用冷盐水进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。 时间：酸化时速度应快些,而碱化时速度可放慢些,二、氨基糖苷类抗生素,(一)、结构与性质,胍基 pK 11.5,甲氨基

11、pK 7.7,链霉素的理化性质,1、酸碱性：强碱性 2、溶解性：易溶于水，难溶于有机溶剂 3、稳定性：较稳定 pH4-7溶液数周内稳定 pH4.0-4.5最稳定 降解反应：酸、碱条件下水解出链霉胍等 4、醛基反应： 与伯胺形成席夫碱,5、成盐： 与磷钨酸、苦味酸、甲基橙等成盐沉淀，用于鉴别 与磺酸、羧酸、磷酸酯成盐，可溶于有机溶剂中，可用于溶剂萃取法。 与某些盐形成复盐，用于精制，如： 链霉素盐酸盐与氯化钙（在甲醇中）形成复盐，复盐溶于水，可通过阴离子交换树脂（SO42-）转为硫酸盐。,(二）链霉素的制备 1、菌种-灰色链霉菌 防止链霉菌株变异的措施： 冷冻干燥法或砂土管法保存菌种，限制有效使

12、用期； 0-4暂存，限制使用期限； 严控传代次数，一般以3次为限； 定期纯化筛选，淘汰退化菌落； 不断选育出高发酵单位的新菌种。,2、发酵工艺,冷冻管,母斜,斜面孢子,孢子培养,27,67d,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,放罐,提取,摇瓶培养,种子培养,种子培养,发酵,28.5,pH=6.57.3,接种量为10%,最后接种 为20%,3、提炼,发酵液,酸化处理,12倍水稀释，草酸酸化 pH2.83.2,加热 70 75 ,酸化液,过滤或离心,板框过滤 离心分离,酸化滤洗液,中和,冷却至15以下，10 NaOH中和pH6.77.2,中和滤液,一次离子交换,110-Na型树脂吸附 （20万U/m

13、l）,饱和树脂,一次洗脱,水洗至澄清， 56H2SO4洗脱,一次洗脱液,二次离子交换,NaOH中和后401树脂 吸附（10万U/ml）,蒸发浓缩液,脱色、无菌过滤、喷雾干燥,先用无盐水挤压，再以8% H2SO4单罐洗脱34次,精制,NaOH中和,114-H型、 330-OH型树脂精制,精制液,活性碳脱色,pH4.35.0,0.2%3% 活性碳，透光度90%以上,精脱液,薄膜浓缩,35/-0.00266mPa （24万36万U/ml）,饱和树脂,二次洗脱,二次洗脱液,硫酸链霉素 成品,三、大环内酯类抗生素,（一）、概述： 结构特点：以大环内酯为母体,共性： 1、无色弱碱性化合物 2、微溶于水，在

14、水中溶解度随温度上升而下降 3、酸性条件苷键易水解，碱性内酯环易破坏,分类 多氧大环内酯类抗生素按碳原子数可分为12元环、14元环和16元环三类，如红霉素、竹桃霉素、吉他霉素、螺旋霉素等； 多烯大环内酯类抗生素具有26-28元大环内酯，含4-7个共轭双键，如制霉菌素 蒽莎大环内酯抗生素又叫环桥类抗生素，如利福霉素,（二）红霉素的主要性质,1、酸碱性：二甲氨基呈碱性 2、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，微溶于乙醚和水，在水中溶解度55时最小 3、稳定性：pH6-8最稳定,（三）制备工艺,1、菌种 红色链霉菌 多组分 主要有效组分-红霉素A 其他成分-红霉素B、C、E,冷冻管,母斜,孢子培养液,

15、孢子培养,37,710d,避光,一级种子罐,繁殖罐,发酵罐,放罐,提取,微孔接种,种子培养,种子培养,发酵,31,pH=6.67.2， 67d,33， 40h,2、发酵工艺,35,65h,37, 79d, 避光,3、提取,发酵液,预处理，过滤,0.1%甲醛，3%ZnSO4 NaOH 调pH7.88.2,滤洗液,树脂吸附,CAD-40树脂吸附，浓度3.5万U/ml 流速1/25(V/V.min),饱和树脂,树脂洗涤,40洗涤，氨水pH10,洗涤后的 饱和树脂,树脂解吸,丁酯用2%氨水混合，丁酯用量 1:0.51,流速1/130(V/V.min),丁酯洗脱液,提取分离,pH4.75.2 醋酸缓冲液,酸性缓冲液,结晶、分离,碱化pH9.810 加热3840,湿晶体,干燥,制颗粒，干燥 (7880 /740mmHg),红霉素 碱成品,四、四环类抗生素,（一）、概述 结构上都含有四并苯母核,（二）四环素性质,1、溶解性： 在pH4.5-7.5之间难溶于水 游离碱能溶于吡啶、甲醇、丁醇等有机溶剂和稀酸、稀碱 盐酸盐能溶于水，不溶或微溶于有机溶剂 2、稳定性： 干燥低温稳定 水溶液碱性条件下不稳定，酸性条件下（pH4-5）较稳定,3、化学反应： 差向异构化：弱酸性pH26 脱水反应：较