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1、RNA原位核酸杂交方法一、基本原理RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交6,7,25 (RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hyb
2、rids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有：(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳
3、定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。但RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点：(1)不同探针种
4、类的选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；(2)有效制止组织和细胞内RNA降解；(3)实验流程中严防RNA酶污染；(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧；(5)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件的更需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA原位杂交成功的必要条件。近几年来RNA原位杂交已得到稳步发展。主要表现在：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位
5、杂交中应用等。从理论上讲，RNA原位杂交已趋成熟和完善，关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中，促进人们对各类基因识别和表达规律的认识。二、RNA原位杂交中的探针(一)探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。1. 单链cDNA探针： 由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原
6、位杂交中已很少见有应用。2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNARNA杂交体稳定。cRNARNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。3. 寡核苷酸
7、探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNARNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针
8、具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。(二)探针的标记在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标
9、记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的R
10、NA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只
11、能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。(三)探针的纯化某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液
12、中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15% 的水，从而溶解一部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。(四)杂交前准备1. 载玻片和盖玻片的处理为有效防止外源性RNA酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片和盖玻片分别浸泡在5 洁消精（苏洲吴县化工二厂）中12小时，用35-40 温水中冲洗30min，再用双蒸水漂洗3次，每次5
13、min，室温下干燥切片后,在180 烤箱内烘烤46小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。2. 明胶涂片制备取10克明胶（Merck）溶于1000毫升4050 双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升25% 硫酸铬钾溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS的终浓度为0.1。将烘烤后的载玻片浸泡在明胶溶液中10min，在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1 多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10
14、min；在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1 多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min，在室温下干燥玻片。60 烤箱内过夜备用。3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备取2-4mg多聚左旋赖氨酸(Sigma)，分子量在300000以上，溶于1ml消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取2030l滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用钻笔标出，室温下干燥切片后，在60烤箱内过夜备用。4. 硅烷涂片的制备取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)(Sigma)溶于250ml丙酮内。将烘烤后的载
15、玻片浸泡硅烷溶液中60min，用双蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60 烤箱内过夜备用。注意事项：载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落，不干扰杂交信号，低背景，经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的RNA酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的溶度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备为RNA原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate
16、 DEPC)水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体后，先切成1.51.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4 多聚甲醛溶液内，置4 冰箱内2 -4小时。再将组织移入30 蔗糖PBS溶液内，4 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80 或-140 超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20 恒冷切片机内停留,待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7m薄片。40 烤箱内干燥切片2小时后储存在-80 或-140 超低温冰箱内备用。6.标本的固定和石蜡切片的制备石蜡切片作RNA原位杂交的，也应严防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的过程同冰冻切片。为防止RNA迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为，沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通
