《慈姑组培苗生产技术规程征求意见稿》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慈姑组培苗生产技术规程征求意见稿（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ICS65.020.20B 31DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T XXXXXXXXX慈姑组培苗生产技术规程Technical specification for arrowhead tissue culture点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出。本标准起草单位：广西农业科学院生物技术研究所。本标准主要起草人：高美萍、江文、韦绍龙、张驰、何芳练、颜梅新、董伟清、张尚文
2、、蒋慧萍、王艳。15慈姑组培苗生产技术规程1 范围本标准规定了广西慈姑组培苗生产环境的消毒灭菌、培养容器和接种器械的清洗、外植体取材、消毒、接种操作、组培苗继代、生根及炼苗、组培苗质量标准及变异苗控制等的技术规程，同时对培养基配制、消毒灭菌以及生产设施建设和设备配置提出了具体要求。本标准适用于广西慈姑组培苗的生产技术规程。2 术语和定义2.1慈姑以地下球茎为商品生产产品的泽泻科慈姑属宿根性水生草本作物。2.2球茎由地下匍匐茎的先端膨大而成扁圆的球茎。2.3顶芽着生在球茎上部的芽。2.4外植体用于接种培养的各种离体的植物材料，如植物各种器官、组织、细胞及原生质体等。本规程规定采用慈姑球茎的顶芽和
3、匍匐茎茎尖作为外植体。2.5慈姑组培苗瓶苗采用慈姑球茎的顶芽和匍匐茎茎尖作为外植体，采用植物组织培养技术在培养容器中进行无性繁殖获得具有完整根、茎、叶的慈姑小植株。2.6植物生长物质指一些调节植物生长发育的物质，如植物激素和植物生长调节剂。2.7继代培养在外植体初次培养的基础上，把所获得的培养物周期性地分株、分割、剪截等转接到新鲜培养基上进行再培养，从而使得以成本增殖的过程，又称增殖培养。2.8变异在组培生产过程中受到种源纯度、培养基、培养条件等因素的影响，导致组培材料或生产出的组培苗植株以及移栽到大田生长的植株遗传特性发生明显变化，其形态上如叶色、叶形、球茎大小、形状、植株高矮等也显著表现有
4、别于原品种植株的特征。3 生产设备（施）、组织培养场所要求及所需化学试剂3.1 生产设备及设施、组织培养场所要求3.1.1 建筑设施组培实验室或组培工厂周围环境必须干燥、洁净，不允许有垃圾或其他污染源，四周通风良好。实验室或组培工厂各部分的配置要合理安排，做到杜绝污染、方便工作，节省能源及使用安全。组培工厂设计包括洗涤室、培养瓶晾干室、药品室、培养基配置室、培养基灭菌室及储存室、更衣室、接种室、培养室、隔离带等。3.1.2 所需仪器及生产设备3.1.2.1 洗涤设备工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机，实验室或小车间可选用普通洗涤用具，如洗涤水槽、塑料盆、塑料桶、塑料框等，由人工洗涤，并配置有干
5、燥箱、凉瓶架等。3.1.2.2 灭菌设备高压蒸汽灭菌锅、器械消毒器、紫外灯、臭氧发生器、烘干箱、电磁炉等。3.1.2.3 接种设备及工具超净工作台、钢丝架、镊子、解剖刀、剪刀、接种针、铝片、垫板、酒精灯或接种工具消毒器等。3.1.2.4 培养设备及组培器具培养所需的空调、冰箱、除湿机、光照培养箱、光照培养架等，及组培所需的玻璃器皿及器材盛装器，如罐头瓶、三角瓶、专制塑料瓶、烧杯、试剂瓶等；计量器皿（量筒、容量瓶、移液管等）以及pH 5.07.0精密试纸、温湿度表、照度计酸度计等实验室常用器具。3.2 常用化学试剂3.2.1 常用消毒灭菌剂选用酒精、高锰酸钾、氯化汞、次氯酸钠、新洁尔灭、来苏水等
6、。3.2.2 组培苗培养常用试剂慈姑组培苗生产所用培养基主要为有机物和无机盐类，应符合附录A的要求。4 培养容器和接种器具的清洗4.1 培养容器的清洗4.1.1 浸泡须先将培养容器中培养基倒掉后放入新洁尔液或洗衣粉溶液中浸泡30 min以上；污染的培养容器应分开浸泡，浸泡时间不少于2 h。4.1.2 清洗用瓶刷洗刷瓶内的残留物；用牙刷清洗瓶盖内残留物。4.1.3 冲洗用自来水冲洗培养容器23遍。4.1.4 晾干及储存将冲洗干净的培养容器倒放在培养容器专用框中晾干，后倒立堆放整齐在通风透气处待用。4.2 接种器具的洗刷清理接种器具（镊子、解剖刀、铝片、垫片等 ）上残留物，在新洁尔液溶液中浸泡10
7、 min以上，用钢丝球洗刷23遍，晾干后用报纸包好，按5.5进行高压灭菌。5 消毒灭菌操作5.1 洗涤室的消毒每天清洗地面，并用来苏水或新洁尔灭等消毒剂喷洒消毒，保持室内清洁。5.2 接种室和培养室的消毒在接种室内定期采用紫外灯灭菌1 h左右，每周定期用0.1%0.2%新洁尔灭对接种室地面、门窗及培养室培养架进行喷雾或擦拭消毒；并定期（一般7 d）用艾叶和苍术混合烟雾熏蒸1 d；每月用杀虫剂、杀螨剂、杀蚁药等药剂喷雾一次。5.3 超净工作台的消毒接种前用紫外灯照射20 min30 min，后用75%酒精喷洒擦拭超净台工作台面及内壁；定期拆洗超净台过滤膜以保证过滤膜清洁。5.4 接种器具的消毒使
8、用前进行高温高压蒸汽消毒；接种过程中采用小型灭菌器（一般消毒30 s左右）或用酒精灯灼烧消毒。5.5 培养基、接种器具及培养容器灭菌组培中采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，适用于培养基、无菌水、接种器具及培养容器等灭菌。通常在压力1.1 kg/cm21.2 kg/cm2、温度121 的条件下灭菌15 min20 min即可。5.6 污染检查及污染组培瓶苗消毒灭菌发现接种材料污染要做好记录，不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖，应当天及时送到洗涤室；将污染瓶内污染废物收集进行无害化集中处理，再清洗培养容器，后用高压灭菌锅对污染的容器高温高压灭菌。6 培养室环境条件的控制6.1 温度培养室温度应
9、控制在(262) ，可根据培养材料所需的最适温度进行调节。广西夏季气温高，须有空调系统控温，保持室内环境稳定。6.2 湿度培养室保持70%80%的相对湿度，广西春夏季空气湿度大，培养室应放置除湿机。6.3 光照一般培养室光照强度控制在1 500lx3 000lx，以每天12 h16 h为宜；须根据培养材料需光特性调整光照强度和设定光照时间；工厂化生产时可考虑利用自然光照以降低成本。7 慈姑组培苗生产操作规程7.1 培养基的配制7.1.1 培养基的选择根据培养材料品种类型及生长发育特性选择相适应的基本培养基种类和植物生长调节剂种类、浓度、配比。慈姑组织培养常用MS基本培养基成分参见附录A。7.1
10、.2 培养基母液的配制与保存7.1.2.1 培养基母液的配制制作培养基前需要先配制母液，母液的配制应用去离子水；根据生产情况，母液可以配制成单一化合物母液或几种化合物的混合母液。大量元素母液和微量元素母液配制参见附录A、B；植物生长调节物质的母液配制浓度0.1 mg/ml1.0 mg/ml，配制方法参见附录C。7.1.2.2 培养基母液的保存母液配制好后贴好标签，注明名称、配制日期，存放4 的冰箱中，存放期间不宜过长（一般不超过2个月），发现有不明沉淀、浑浊或变色则停止使用。7.1.3 培养基制作7.1.3.1 准备根据培养基成分准备好各类母液、蒸馏水、固化剂和蔗糖等。7.1.3.2 混合定容
11、将蒸馏水、各类母液、蔗糖和固化剂混合，搅拌加蒸馏水定容后加热溶解。7.1.3.3 pH值调整充分搅拌后，用pH试纸测试pH值，用0.1 mol/L的HCL或0.1 mol/L的NaOH调节pH至要求值，一般为5.60.2。7.1.3.4 分装根据不同需要定量分装，如250 ml的培养瓶，每升分装2530瓶，每瓶分装33 mL40 mL左右。7.1.3.5 封口灭菌盖好瓶盖后，尽快高压灭菌。7.1.3.6 冷却贮存灭菌后的培养基应及时放到无菌室中冷却凝固，注明培养基编号及消毒日期，存储于培养基储藏室。贮存时间一般不超过1个月。7.2 外植体采集与处理7.2.1 外植体的采集从具有品种典型性状的无
12、病虫害的优良品种（如桂慈1号）选择球茎或匍匐茎，切取健壮的顶芽或匍匐茎茎尖作为外植体。7.2.2 无菌外植体7.2.2.1 准备根据灭菌处理方法准备好无菌水、0.1%升汞、75%酒精及烧杯、镊子等。7.2.2.2 材料预处理将采集的球茎顶芽或匍匐茎放入加有洗衣粉或洗洁精的温水中浸泡30 min左右，用自来水冲洗23遍，剪取所需幼芽茎段（2 cm3 cm），置于接种室中晾5 min10 min。7.2.2.3 球茎顶芽的灭菌7.2.2.3.1 在超净台上，将预处理的慈姑球茎顶芽放入烧杯中，倒入75%酒精，轻轻摇晃1 min左右,倒出酒精，用无菌水冲洗外植体35遍。7.2.2.3.2 再用0.1%
13、的升汞消毒10 min15 min,或2%次氯酸钠浸泡10 min15 min，然后用无菌水冲洗35遍后备用。7.2.2.4 匍匐茎茎尖的灭菌7.2.2.4.1 在超净台上，将预处理的慈姑匍匐茎茎尖放入烧杯中，倒入75%酒精，轻轻摇晃10 s30 s左右,倒出酒精，用无菌水冲洗外植体35遍。7.2.2.4.2 再用0.1%的升汞消毒8 min10 min,或2%次氯酸钠浸泡8 min10 min，然后用无菌水冲洗35遍后备用。7.3 接种和增殖培养7.3.1 接种接种人员应在更衣室更换拖鞋、白大褂，戴上口罩和帽子后方可进入接种室。操作人员洗手后用75%的酒精喷手于操作台内吹干。取苗时要注意瓶口
14、不要斜向外，一次不宜取太多；取苗时镊子尽量不要碰到瓶壁或瓶口。7.3.2 初代培养（诱导培养）消毒外植体先接种在1/2 MS+ 6-BA 0.5 1.0 mg/L+NAA 0.010.05 mg/L +30 g/L的培养基上，温度在(262) ，光照1 000 xl2 000 xl,每日光照16 h,培养7 d10 d。7.3.3 继代培养 将初代培养所得丛生芽，高度2 cm5 cm,小叶片25片，去其黄化和发育不良的植株，分切成单个芽点转接到MS+6-BA 23.5 mg/L+NAA 0.10.5 mg/L +糖30 g/L的继代培养基上，温度在(2620) ，光照1 500 xl3 000
15、 xl,每日光照12 h。根据培养材料的发育及长势，适当调整继代培养基中植物生长调节剂的用量和比例，保证继代材料的正常生长，使其按合理、安全（变异率低）的增殖系数繁殖，植物生长调节剂的使用浓度和作用参见附录C。一般情况下，28 d为一个继代周期，增殖系数控制在2.05.0范围，一般控制在811个继代周期。7.4 组培苗的生根和培养7.4.1 组培生根材料的选择选择继代培养材料中叶色正常、生长健壮的继代苗，增殖和分化同时进行，将分化苗接种在MS+ 6-BA 0.51.0 mg/L +NAA 0.5 1 mg/L +糖30 g/L 的培养基生根。7.4.2 组培苗生根的培养接种后，放置在温度(262) ，光强2 000 LX的光照培养室内，培养10 d15 d，苗高5 cm8 cm，茎粗壮，根系发达，即可转
