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1、利用离心装置简化样本超滤利用离心装置简化样本超滤 借助Pall公司离心装置，许多常用的核酸和蛋白质处理程序得 以简化。对于体积在50L到60mL之间的样本，这些离心装置 能在短短几分钟时间内高效完成浓缩与脱盐处理。为确保非特 异性低生物分子结合， 并连续、 高效 （回收率通常应当高于90%） 地回收目标分子，应选择适当的滤膜。 超滤方法超滤方法 作为一种滤膜分离技术，超滤用于分离流体中极其细小的微粒 以及溶解的分子。分离的主要依据在于分子大小，尽管其它因 素（譬如分子形状以及所带电荷）也起着一定的作用。大于滤 膜孔径的分子将被滞留在滤膜表面 （而非被多微孔滤膜截留的 聚合物基质中），并在超滤进
2、程中被浓缩。 对比膜处理之外的其它技术（层析、透析、溶剂提取或者离心 分离），超滤技术优势如下： ? 对于分子的处理远比其它方法温和 ? 无需有机萃取，从而避免不稳定蛋白质的变性可能 ? 维持离子及pH环境不变 ? 快捷，成本相对低廉 ? 可在低温下进行处理（譬如在冷藏室中），而且 ? 效率很高，能够同时进行分子的浓缩和纯化处理 超滤滤膜的截留性质表现为截留分子量大小，其数值为：滤膜 截留率为90的稀释球形溶质（即：典型蛋白质）的近似分子 量。然而，分子的形状能够直接影响滤膜对于此分子的截留。 譬如，同样的滤膜孔隙，线性分子（例如DNA）可以通过，分 子量相同的球形分子却将被截留。 超滤的三种
3、常见应用： 1. 浓缩浓缩利用超滤技术，能够非常方便地进行稀释蛋白质或 DNA/RNA样本的浓缩处理，此浓缩处理非常温和（不会对 DNA造成高达100千碱基对的剪切，也不会造成蛋白质中 酶活性的损失），且非常高效（回收率常常高于90）。 2. 脱盐及缓冲液置换（渗滤）脱盐及缓冲液置换（渗滤）利用超滤技术，能够非常方便、 高效地去除/置换盐分、去除清洁剂、分离游离分子和结合 分子、去除低分子量材料或者快速地改变离子或pH环境。 3. 分馏分馏对于分子量相近的两种分子，利用超滤技术不能将其 彻底分开。待分离的分子之间，必须在分子大小上相差至 少一个数量级（10X），方能达成有效分离。在分馏中利 用
4、超滤技术，在诸多应用中效果很好，譬如：无游离蛋白 质滤出液的制备，从DNA和蛋白质样本中分离未结合或游 离的标记物，以及合成反应中PCR产物的纯化。 基于样本体积选择装置基于样本体积选择装置 表表1 基于样本体积选择装置 装置装置 样本体积样本体积 AcroPrep 384孔过滤板 100 L AcroPrep 96孔过滤板 350 L Nanosep装置 0.5 mL Microsep装置 0.5 3.5 mL Macrosep装置 3 15 mL Jumbosep装置 15 60 mL 基于应用选择滤膜基于应用选择滤膜 在各种广泛的应用挑战中，这些滤膜均表现出卓越的性能和稳 定性： ? O
5、mega聚醚砜超滤滤膜快捷的浓缩及脱盐处理 ? Bio-Inert改性尼龙及亲水性GHP （Pall公司专利所有） 微细过滤滤膜去除微粒物质（譬如凝胶碎片） 选择适当的截留分子量选择适当的截留分子量 一旦选定样本体积，接下来就是选择适当的截留分子量（对于 超滤而言）或孔径 （对于微细过滤而言）。作为额定值，截留 分子量基于：对于分子量（以千道尔顿为单位） 已知溶质90% 以上的截留能力。表2中，列举了各种滤膜（不同截留分子量） 对于一些溶质的截留性质。就蛋白质而言，建议选用的截留分 子量， 应小于欲截留溶质的分子量3到6倍。 如果需要考虑流速， 滤膜截留分子量的选择应当小于欲截留溶质的分子量3
6、倍； 如果 重点关注截留，可以选择更加紧密的滤膜，即小于欲截留溶质 的分子量6倍。 有必要认识到：多种因素决定了超滤滤膜对于分子的截留，其 中，分子量只能作为一项概括的指标。因此，为特定应用选择 适当的的截留分子量，需要综合考虑众多因素（包括：分子形 状、分子所带电荷、样本浓度、样本成分以及操作条件）。 确定滤膜的截留分子量时，不同的滤膜制造商会使用不同的分 子，由此，在特定应用中，有必要进行测试性试验，验证滤膜 的性能。 提升分子通过率的常见参数：提升分子通过率的常见参数： ? 样本浓度低于1mg/mL ? 线性（相对球形分子而言） ? 离心浓缩器中离心加速度导致较高跨膜压 （对于DNA片断
7、 之类线性分子而言特别重要。降低离心加速度，能够提高 滤膜对于分子的截留效率） ? 有利于分子断裂的缓冲液组成 ? 改变分子的pH和离子环境 （譬如： 导致其构造改变或聚集） 降低分子通过率的常见参数：降低分子通过率的常见参数： ? 样本浓度高于1mg/mL ? 允许分子聚集的缓冲液条件 ? 存在增加样本浓度的其它分子 ? 较低的跨膜压（就离心浓缩器而论，降低离心加速度） ? 到滤膜或装置的吸附 ? 低温（相对于24而言的4） 对应各种不同的截留分子量，Pall Life Sciences离心装置备有 各种颜色的编码，以方便选择。 表表2 蛋白质应用中的截留分子量选择蛋白质应用中的截留分子量选
8、择 截留分 子量 截留分 子量 滤膜标称孔 径 滤膜标称孔 径* 生物分子大小生物分子大小 生物分子， 分子量生物分子， 分子量 1K 3K - 10K 3K 10K - 20K 5K 15K - 30K 10K 30K - 90K 30K 9K - 180K 50K 5 nm 15 30 nm 150K - 300K 100K 10 nm 30 90 nm 300K - 900K 300K 35 nm 90 200 nm 900K 1,800K 1000K100 nm 300 600 nm 3000K 核酸应用中的截留分子量选择核酸应用中的截留分子量选择 截留分子量截留分子量 碱基对（碱基对
9、（DS） 碱基（碱基（SS） 1K 5 16 Bp 9 32 Bs 3K 16 32 Bp 32 65 Bs 5K 25 50 Bp 50 95 Bs 10K 50 145 Bp 95 285 Bs 30K 145 285 Bp 285 570 Bs 50K 240 475 Bp 475 950 Bs 100K 475 1,450 Bp 950 2,900 Bs 300K 1,450 2,900 Bp 2,900 5,700 Bs 1000K 4,800 9,500 Bp 9,500 Bs 病毒应用中的截留分子量选择病毒应用中的截留分子量选择 截留分子量截留分子量 滤膜标称孔径滤膜标称孔径*
10、病毒或微粒的直径病毒或微粒的直径 50K 5 nm 15 30 nm 100K 10 nm 30 90 nm 300K 35 nm 90 200 nm 1000K 100 nm 300 600 nm *标称孔径应为电子显微镜下的具体测量结果（标称孔径应为电子显微镜下的具体测量结果（50K仅为估计 值） 仅为估计 值） 用于工艺放大的产品用于工艺放大的产品 ? 96孔或384孔的AcroPrep过滤板， 适用于多路并行处理 ? 超滤滤膜片，提供更快流速和更高回 收率；并可用于常规的stirred cells搅 拌式超滤装置中 （请参阅第62 - 63页） ? 组装轻松的自主式Stirred Cell搅拌式超滤系统，处理样本 体积从2毫升到150毫升（请参阅第60-61页） ? Minimate及Ultrasette 切向流过滤器，快速处理从50 毫升到5升体积的样本（请参阅第138和148页） ? Minimate及Ultralab 泵系统（请参阅第140和149页） 欲了解超滤更多相关信息，请参考第130-135页（“实验室生 物制程”章节中）
