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1、2019/10/5,2,欢迎同学们学习,分子遗传学,分子遗传学,教师：刘若余 联系电话：0851-3864327，13984812913,基因组多态性,基因组多态性：在不同群体或个体之间，基因组的某些位点上碱基的差异。这种差异也称之为分子遗传标记。 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征 在经典遗传学中,遗传多态性是指等位基因的变异. 在现代遗传学中,遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异.,DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映.DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异,哪怕是单个核苷酸的变异.因此,DNA标记在数量上几乎是无限的.,DNA遗传标记特点： 1.直接
2、反映基因特征，非推测。 2.基因座位数量多，无论表达与否。 3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强。 4.适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。,DNA多态性的分类 1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列，首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复（variable number of tandem repeat,VNTR） 短串联重复(short tandem repeat,STR) A：产生原因：DNA滑动与同源染色体 不等交换。,2）序列多态
3、性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。 单核苷酸多态性 （single ucleotidepolymorphism,SNPs） 原因：碱基的置换、插入、缺失。 特点：多位于非编码区，选择压力。 数量多，1/1000 bp，300万 二态性，2个等位基因，多态性 程度较低。 孤立事件，人类遗传学意义大。,DNA标记的分类,依据多态性的检测手段,DNA标记可分为四大类: (1)基于DNA-DNA杂交的DNA标记. 该标记技术是利用限制性内切酶及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子,然后用经标记的DNA探针,通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性.其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的R
4、FLP标记.,(2)基于PCR的DNA标记. 根据PCR所用的引物特点,这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记.随机引物PCR标记包括RAPD标记和ISSR等,随机引物PCR所扩增的DNA区段事先未知,具有随意性和任意性,因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究.特异引物PCR标记包括SSR标记和STS标记等,特异引物PCR所扩增的DNA区段事先是已知的明确的,具有特异性.因此特异引物PCR标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解.,(3)基于PCR和限制性酶切技术结合的DNA标记.这类DNA标记可分为二种类型,一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制
5、性片段长度的多态性,如AFLP标记.另一种是通过对PCR扩增的片段的限制性酶 切来揭示被扩增的区段的多态性,如CASP标记.,4)基于单核苷酸多态性的DNA标记,如SNP标记.单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记 。它也是以以PCR技术为基础的分子标记技术。,基于遗传标记的发展历程,第一代标记 经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） 70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP） 第二代标记 85年，“小卫星序列“（minisatellite） 89年，“微卫星序列“（microsatellite） 第三代标记 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymo
6、rphism ，SNP）,经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） ABO血型位点标记 HLA位点标记（人类白细胞抗原） 存在问题： 已知多态的蛋白质很少 等位基因的数目有限 无法获得足够的信息量 检测技术的繁琐等 限制了人类基因组的遗传分析工作 促使人们直接在DNA上寻找遗传标记,遗传标记中的第一代标记,蛋白质和免疫学的标记,同工酶的多态性,EsD分型示意图,遗传标记中的第一代标记,RFLP( restriction fragment length polymorphism) 标记技术 RFLP即限制性片段长度多态性.是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有
7、差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。 限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列,并在这些序列位点上切断DNA分子的酶.,限制性片段长度多态性的DNA基础 （1） 识别部位的点突变：碱基的替换、修 饰（甲基化）或插入与缺失。 （2） 识别部位间的片段插入与缺失。 （3） 识别部位间的重复序列数目的变化。,DNA限制性内切酶 restriction endonuclease 能够识别特定的DNA序列，与DNA分子结合后在特定部位将DNA双链切断的核酸水解酶。 （1）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。 （2）命名：根据微
8、生物的种（第一个字母大 写）、属（前二个字母小写）、变种第一个 字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。 （3）分类： A：型：远离识别部位随即切割，非特异。 B：型：在识别部位内部切割，特异。 C：型：在识别部位后定点切割，特异。 单位：1U：在标准条件下，1h完全水解1g噬菌体的酶量。,型DNA限制性内切酶： A：识别核酸序列数目4-6个。 B：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平 末端。 例：Pst 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Hae 5-GGCC-3 3-CCGG-5,分型法： RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。 RFLP技术主要包括以下基本
9、步骤： DNA提取 用限制性内切酶酶切DNA 、 用凝胶电泳分开DNA片段 把DNA片段转移到滤膜上 利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。,特点 A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。 B RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰 D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。,P
10、CR-RFLP,PCR-RFLP Analysis,微卫星标记技术,真核生物基因组中广泛存在着串联重复序列。根据重复单位大小的不同，将重复序列分为三 类：卫星序列、小卫星序列和微卫星序列。 卫星DNA: 序列重复单位的长度最常见的是100300bp,有时可达几千bp,这些基元的拷贝数是1000100000,形成很长的成串的重复结构.通常存在于异染色质，主要分布在着丝粒区域。 小卫星DNA:是一些重复单位在1060bp,总长度由几百到几千个bp串联重复序列,它主要存在于近端粒处,在不同的个体间存在着串联数目的差异,表现出高度的个体特异性,且以孟德尔方式稳定地遗传和分离,通常又被称为DNA指纹.该
11、类可通过RFLP的方法加以鉴别.,简单序列重复标记，SSR,又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记； 属高度重复序列，重复单元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,一个家系的微卫星PCR检测结果,SSR标记的主要特点,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多
12、的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,微卫星DNA多态形成的机制,微卫星位点由其核心序列(core sequence)和两侧的侧翼序列(flanking sequence)共同构成,侧翼序列具有位点特异性,而微卫星本身的重复数变异则提供了微卫星位点产生多态性的基础.重复数越大,其变异性也越大,等位基因数也越多. 引起微卫星位点发生突变的原因主要为“滑链错配”（slipped-strand mispairing)。在DNA 复制合成的过程中，新生链和模板
13、链之间在微卫星重复区域可能发生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状，未能参与配对。如果未配对的重复单位位于新生链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链多。反之，如果未配对的重复单位位于模板链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链少.,微卫星的检测,1基因组DNA制备 2微卫星DNA的扩增：反应总体积为25L 3SSR标记电泳检测：分3个主要环节。 1）电泳： 采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,设恒定功率,预电泳约30min后,加扩增样品DNA46L,电泳4060min(视分子量大小及差异带的可辨度调整电泳时间)。 2）染色： SSR PCR扩增产物电泳之后用银染法来检测扩增产物,不
14、仅可避免使用同位素,而且分辨率很高,甚至能检测出1ng以下的DNA。 3）统计分析：根据不同的研究目的,应用相关软件进行分析。,基因型判定,由于在变性胶中PCR产物是单链，并且不受其碱基组成影响，因此，如果微卫星PCR产物两条互补链分子质量相近，在变性胶中纯合子为单带，杂合子为双带；如果微卫星PCR产物两条互补链分子质量相差较大，在变性胶中纯合子为双带，杂合子为四条带。,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP),A. 定义 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 不同个体间，基因组DNA某部位的
15、单核苷酸的变异。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标记（single nucleotid polymorphism SNP） 制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,B. SNP在人类基因组中出现的频率 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达1700万个甚至更多。 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变
16、异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding sNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。,C. SNP检测方法 目前已有多种方法可用于SNP检测： 直接测序. 单链构像多态性single strand conformation polymorphism,SSCP). 寡聚核苷酸特异的连接； DNA芯片以及TaqMan系统等。 但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。,D. SNP用作遗传标记的优点 (1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。 (2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。 (3)与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分
