《2020年肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2020年肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述 传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段以下是小编搜集的一篇关于肠道微生物组的现代分子生物学研究方法探究的论文范文欢迎阅读查看 引言 微生物遍布于人体所有与外环境相通的器官成人胃肠道黏膜表面积达300m2,是与外界环境接触并相互作用的最大区域在其中定殖着约11014个微生物数量是人体体细胞总数的10倍肠道微生物参与宿主的能量吸收和储存帮助宿主降解并吸收食物中的营养成分还能促进免疫细胞分化与成熟、激活肠道免疫系统13,具有非常重要的生理意义但是由于人体肠道复杂的厌氧环境40%80%的肠道微生物难以在体外培养仅凭培养手段进行微生
2、物组研究会大大削弱肠道微生物的多样性随着分子生物学技术的飞速发展利用分子生物技术研究肠道微生物组的技术取得了极大的进展掌握并运用这些新技术对肠道微生物组的研究十分关键该文主要对肠道微生物组的现代分子生物学研究方法进行总结和介绍 1传统纯培养检测方法 传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量但由于传统微生物培养技术中菌株的富集或衰减不可避免原始的微生态结构被改变这会导致研究结果存在较大偏差 Moore等4利用传统培养方法对20例男性的粪便样品中微生物种类和相对数量进行了研究研究对象包括日本
3、到夏威夷的6080岁的健康个体食谱包括东西方饮食将取到的粪便样品进行培养分析得到1147个纯培养物鉴定为113种不同的微生物然而据报道人体肠道至少存在400种微生物4,因此这种培养方法会漏掉多数的、营养条件要求更为苛刻的微生物 2传统分子生物技术 2.1肠道菌群DNA提取技术 从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物分子生物技术研究的基础目前提取肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商业试剂盒如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QI
4、AampDNAStoolMinikit等其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到较多肯定试剂盒应用方便、快捷但价格昂贵处理大批样品时科研成本太高相较而言酚/氯仿抽提法快速且成本低适合用于肠道微生物研究中总DNA提取尤其适合处理大批量样品 2.2构建基因文库测序技术 2.2.1构建16SrRNA基因文库 16SrRNA基因克隆文库通过扩增各种细菌共有基因序列片段对细菌进行定性定量分析是一种有力的细菌学检测分析手段现已广泛用于肠道和人体其他部位微生物多样性研究57,并通过该方法发现了许多尚未培养到的菌种16SrRNA基因克隆文库技术可以分析标本中的菌群结构反映各种细菌的相对比例
5、及数量具有培养法难以比拟的优势不足之处是实际操作中技术环节多、影响因素复杂、不同实验室操作条件难以标化以及对标本中的细菌数量有一定要求等但相信随着技术的不断提高16SrRNA基因序列分析将逐步成为微生物组结构研究的有力工具 2.2.2全基因组鸟枪测序分析技术 Gill等8利用全基因组鸟枪(Shotgun)测序技术分析了两名健康成年人粪便中的菌群首次对人体肠道微生物多样性进行了全面的描述 Qin等9运用深度Shotgun测序法研究发现型糖尿病患者的肠道菌群中度失调产丁酸盐细菌丰度降低而致病微生物的功能增加相较于传统的基于rRNA的研究Shotgun测序分析技术可以找到更多的进化标记得到更多的菌群
6、信息且Shotgun技术不需PCR扩增因此分析出的结果偏差较小;此外通过序列数据分析还可以对微生物基因表达及功能状态情况进行研究其缺点在于微生物系统组成复杂将大量的序列信息正确地装配成每个成员的基因组全序列是一个较大的难题 2.3遗传指纹图谱技术 构建基因文库的方法可以得到样本中的菌群种类和相对进化信息然而我们常需要对整个肠道微生物组进行动态监测构建基因文库方法会显得费时、费力不能做出快速检测这时遗传指纹图谱技术可克服上述不足快速灵敏地检测生态系统的动态变化 2.3.1变性梯度凝胶电泳及其衍生技术 变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DG
7、GE)技术是由Fisher等发明的Muyzer等首次将其应用于微生物群落结构研究随后Zoetendal将其用于人体肠道菌群的分析研究后来在其基础上衍生出温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophesis,TGGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE)、脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)和单链构象多态性检测(singlestrandedconformationalpolymorphisms,SSCP)等此后该技术被广泛应用于消
8、化道排泄物中微生物的分析1011. DGGE及其衍生技术既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异鉴别细菌种类也可以研究同一个微生物群落随时间和环境改变的动态变化过程但该技术用通用引物进行PCR扩增时可能会忽视一些数量较少的细菌并且肠道微生物组种类繁多最终获得的电泳条带复杂且拥挤增加了结果分析的困难 2.3.2随机扩增多态性 DNA技术随机扩增多态性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术利用寡核苷酸序列在基因组上随机配对的特性经扩增得到一系列大小不同的产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳便可得到一系列基于RAPD的指纹图谱因为不同模扳DNA产
9、生的指纹图谱有差异因此可用于鉴定微生物种类并且灵敏度高常被用于细分微生物组内的种群差异1112. RAPD技术的缺点在于重复性和稳定性差产生的图谱条带过于复杂需要进行大量的筛选从中找到较为合适的引物进行分析较为费时 2.3.3末端限制性片断长度多态性分析技术 末端限制性片断长度多态性分析(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,TRFLP)技术通过自动测序仪分析酶切后的末端序列达到定量的目的因为末端序列来自16SrDNA,因此可用于复杂的肠道微生物群落结构的研究快速灵敏地评估群落中微生物的多样性并给出微生物群落结构的指纹图谱是目前被广泛采用
10、的一种指纹图谱技术现已成功应用于各种微生物群落结构和多态性的比较分析1314. 其缺点在于该技术只检测末端序列因此不可避免地会低估微生物群落结构多态性同时它是基于PCR扩增技术实验过程影响因素较多亦会对结果造成影响 2.4荧光原位杂交技术 除了上述技术外分子杂交技术也被广泛应用于肠道微生物组的研究中同样表现出应用潜力和优点 Giovannoni等首次应用荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术进行细菌学的研究随后Delong等使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞经过不断的丰富和完善FISH技术已成为近年肠道微生物研究中一种重要的检测工具
11、1516.其利用荧光素标记16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探针与靶细菌杂交通过检测目标序列来鉴定微生物具有敏感、快速、安全等优点 FISH技术还可用于鉴定和检测未培养种属和新种属其缺点在于FISH技术尚不能用于16SrRNA序列未知微生物的检测且在操作时易受到污染干扰同时结果会受到微生物营养状态的影响 由于肠道微生物组种类繁多而联合流式细胞学技术可进行高通量分析已越来越多地应用于FISH信号检测 3新近发展的方法技术 3.1基因芯片技术 基因芯片技术(DNAchips)原理是使探针分子在滤膜、硅片、玻璃等介质上排列成微矩阵将待检样品标记后与微矩阵杂交通过检测样品杂交信号强度即可获得样品中基因
12、序列及数量等信息具有快速、高效、低成本等优点现已广泛应用于微生物群落结构及功能的研究1719,并且其敏感性和特异性已经得到了反复验证2021. 目前尚没有应用基因芯片进行人体肠道微生物研究的报道但基因芯片包括大量针对人体肠道微生物的功能基因并且其子类型HummChip是专门针对人体微生物设计的因此基因芯片技术应用于肠道微生物研究不存在技术问题 3.2宏基因组学技术 宏基因组学即将环境中全体微生物的遗传物质看作一个整体系统全面地研究微生物与其生存环境之间的关系通过宏基因组测序技术可发现肠道菌群结构改变结合其代谢特征可分析肠道微生物与代谢性疾病之间的联系宏基因组学还可用来发现新发传染病病原以及未知
13、病原美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)的人类微生物组计划2223利用宏基因组学技术分析了242个美国健康志愿者微生物基因组获得了近800个菌种的基因参考序列 宏基因组学技术为肠道微生物组的研究提供了新的思路与方法为充分认识和利用未培养微生物、完整地从群落水平上认识微生物开辟了新的道路 3.3第二代测序技术 年底Roche公司建立454测序技术该技术结合DNA扩增乳胶和皮升级反应孔进行焦磷酸盐测序可对微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系进行研究具有速度快、通量高、读长长、准确性高、一致性好及简便高效的优势 Go
14、salbes等24运用454测序技术对10位健康人的肠道微生物群落结构和组成进行了研究发现发现厚壁菌门占49.18%,拟杆菌门占31.42%,变形菌门占3.6%,放线菌门占0.4%.454测序技术在肠道微生态研究中已经得到较为广泛的运用25,然而454测序同样存在着缺点主要在于片段长度短对连续单碱基重复区域测序准确性差常会产生缺失或者插入误差但随着454测序分析技术的发展成熟终将得到更准确、可靠的结果 相较于454测序技术Illumina测序表现出低错误率、低成本和高通量等优势2627.但是Illumina测序长度短所获得的序列数量巨大呈数十倍增长原有生物信息学分析工具无法计算因此解决其运算问
15、题是Illumina用于微生物群落分析的关键之处随着Illumina测序读取长度的改善及新型分析工具的开发预计Illumina测序技术将因其高性价比的优势广泛应用于肠道微生物组的研究 4展望 从1975年Woese等首次应用rRNA分析菌群以来rRNA数据库迅速扩大16SrRNA基因作为细菌的标志已逐渐成为临床细菌分类、鉴定的金标准传统分子生物学技术多以16SrRNA基因为基础Shotgun测序费用高昂且分析过程繁琐复杂目前难以大规模推广使用DGGE技术相对简单高效TRFLP较为方便快捷基因芯片用于个体间肠道菌群对比时灵敏性较好且具有高通量特点预计可广泛应用于临床检验宏基因组测序可保留样本中全部菌群的信息在肠道菌群多样性研究中正逐渐盛行焦磷酸测序能自动化检测大量的样本近年来发展迅速然而分子生物学技术均为多学科技术融合渗透的成果必然在某些方面存在不足和一些亟待解决的关键问题且这些方法都受制于样本中获得的DNA质量及其PCR效果但随着科学技术的不断发展相信这些问题会得到解决相关技术一定会在肠道微生物的研
