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1、19 TECHNOLOGY e-Science 技术 e-Science 总第6期 DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。自从1977年第一代测序 技术问世以来，经过三十几年的努力，DNA测序技术已经取得了很大的发展， 在第一代和第二代测序技术的基础上，以单分子测序为特点的第三代测序技 术已经诞生。本文回顾了每一代测序技术的原理和特点，并对测序技术的发 展趋势和它在生物学研究中的应用做了展望，以期更好地帮助人们理解测序 技术在生命科学研究中的重要作用。 摘 要： 第一代测序技术；第二代测序技术；第三代测序技术；基因芯片技术 关键词： The Development and Futur
2、e Perspectives of DNA Sequencing Technology Sun Haixi1,2 ,Wang Xiujie1 1 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China DNA sequencin
3、g technology has played important roles in modern biological research. The first generation of sequencing technology appeared in 1977. During the past decade, the so-called next generation sequencing technologies had emerged and caused a revolution in biological research. Recently, the third generat
4、ion sequencing technology, which is able to determine the base composition of single DNA molecules, has joined the race. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their future perspectives will be discussed here. first generation sequencing technology; second genera
5、tion sequencing technology; third generation sequencing technology; microarray Abstract: Keywords: DNA测序技术发展及其展望 孙海汐1,2 王秀杰1 1.中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室，北京100101 2.中国科学院研究生院，北京100049 20 TECHNOLOGYe-Science 技术 e-Science 2009年 1.引 言 快速和准确地获取生物体的 遗传信息对于生命科学研究一直 具有十分重要的意义。对于每个 生物体来说，基因组包含了整个 生物体的遗传信
6、息。测序技术能 够真实地反映基因组DNA上的遗传 信息，进而比较全面地揭示基因 组的复杂性和多样性，因而在生 命科学研究中扮演了十分重要的 角色。 测序技术最早可以追溯到 20世纪50年代，早在1954年就已 经出现了关于早期测序技术的报 导，即Whitfeld等用化学降解的 方法测定多聚核糖核苷酸序列1。 1977年Sanger等发明的双脱氧 核苷酸末端终止法和Gilbert等 发明的化学降解法，标志着第一 代测序技术的诞生2, 3。此后在 三十几年的发展中陆续产生了第 二代测序技术，包括Roche公司 的454技术4, 5、Illumina公司的 Solexa技术6-8和ABI公司的SOL
7、iD 技术9, 10。最近，Helicos公司的 单分子测序技术11-13、Pacific Biosciences公司的单分子实时 (Single Molecule Real Time, SMRT)测序技术14, 15和Oxford Nanopore Technologies公司正在 研究的纳米孔单分子测序技术16被 认为是第三代测序技术17。测序 技术正在向着高通量、低成本、 长读取长度的方向发展18。 2.第一代测序技术 测序法（pyrosequencing）21、 连接酶测序法（sequencing by ligation, SBL）22、杂交测序法 （sequencing by hyb
8、ridization, SBH）23等。其中焦磷酸测序法即 为后来Roche公司454技术使用的 测序方法，连接酶测序法即为后 来ABI公司SOLiD技术使用的测序 方法。 3.第二代测序技术 尽管第一代测序技术已经帮 助人们完成了从噬菌体基因组到 人类基因组草图等大量的测序工 作，但由于其存在成本高、速度 慢等方面的不足，并不是最理想 的测序方法。经过不断的开发和 测试，进入21世纪后，以Roche 公司的454技术4, 5、Illumina公 司的Solexa技术6-8和ABI公司的 SOLiD技术9, 10为标志的第二代测 序技术诞生了。与第一代技术相 比，第二代测序技术不仅保持了 高准
9、确度，而且大大降低了测序 成本并极大地提高了测序速度。 使用第一代Sanger的测序技术完 成的人类基因组计划，花费了30 亿美元巨资，用了三年的时间； 然而，使用第二代SOLiD的测序技 术，完成一个人的基因组测序现 在只需要一周左右的时间。由于 第二代测序技术产生的测序结果 长度较短，因此比较适合于对已 知序列的基因组进行重新测序， 而在对全新的基因组进行测序时 还需要结合第一代测序技术。下面 对三种第二代测序技术的原理和特 早在1954年，Whitfeld等就 提出了测定多聚核糖核苷酸链的 降解法1，该方法利用磷酸单酯酶 的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化 作用从链末端逐一分离寡核糖核 苷酸并
10、测定其种类。但由于操作 复杂等原因，该方法并没有被广 泛应用。 在1977年，Sanger等提出了 经典的双脱氧核苷酸末端终止测 序法2。该方法的原理是：由于 ddNTP的2和3都不含羟基，在 DNA合成反应中不能形成磷酸二酯 键，因此可以被用来中断DNA合成 反应。在4个DNA合成反应体系中 分别加入一定比例的带有放射性 同位素标记的某种ddNTP，通过 凝胶电泳和放射自显影后，可以 根据电泳带的位置确定待测分子 的DNA序列。同一年，Gilbert等 提出了化学降解法3。该方法与 Sanger法类似，都是先得到随机 长度的DNA链，再通过电泳方法读 出序列。二者的不同之处在于， Gilbe
11、rt法是先用特定的化学试剂 标记碱基再用化学方法打断待测 序列，而Sanger法是通过ddNTP随 机中断合成待测序列。 此后，在Sanger法的基础 上，80年代中期出现了以荧光标 记代替放射性同位素标记、以荧 光信号接收器和计算机信号分析 系统代替放射性自显影的自动测 序仪19。另外，90年代中期出现 的毛细管电泳技术使得测序的通 量大为提高20。 除此之外，这一时期还出现 了一些其他的测序方法，如焦磷酸 21 TECHNOLOGY e-Science 技术 e-Science 总第6期 点分别加以具体介绍。 1）Roche公司的454测序技术 454测序系统是第二代测序 技术中第一个商业
12、化运营的测序 平台4。它的原理是4, 24, 25 （图 15）： 待测DNA文库的构建 把 待 测 序 列 用 喷 雾 法 (nebulization)打断成300-800 bp 的小片段并在小片段两端加上不 同的接头，或将待测序列变性后 用杂交引物进行PCR扩增，连接载 体，构建单链DNA(ssDNA)文库。 Emulsion PCR 将这些ssDNA与水油包被的直 径大约28 m的磁珠在一起孵育、 退火，由于磁珠表面含有与接头 互补的寡聚核苷酸序列，因此 ssDNA会特异地连接到磁珠上。同 时孵育体系中含有PCR反应试剂， 因此可以保证每一个与磁珠结合 的小片段都会在各自的孵育体系 内独
13、立扩增, 扩增产物仍可以结 合到磁珠上。反应完成后，破坏 孵育体系并富集带有DNA的磁珠。 经过扩增反应，每一个小片段都 将被扩增大约100万倍，从而达到 下一步测序反应所需的模板量。 测序 预 先 用 B a c i l l u s stearothermophilus 聚合酶和 单链结合蛋白处理带有DNA的磁 珠，然后将磁珠放置在一种叫做 PicoTiterPlate(PTP)的平板上。 PTP板上含有很多直径约为44 m 的小孔，每个小孔仅能容纳一个 磁珠，通过这种方法固定每个磁 图1 454测序技术流程 珠的位置以监测接下来的测序反 应。测序反应采用焦磷酸测序 法，将一种含有比PTP板
14、上小孔直 径更小的磁珠放入小孔，启动测 序反应。测序反应以磁珠上大量 扩增的ssDNA为模板，每次反应加 入一种dNTP进行合成反应。如果 这种dNTP能与待测序列配对，则 会在合成后释放焦磷酸基团。释 放的焦磷酸基团会与反应体系中 的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生 成的ATP和荧光素酶共同氧化反 应体系中的荧光素分子并发出荧 光。测序反应产生的荧光信号由 放置在PTP板另一侧的CCD照相机 记录，再经过计算机分析转换为 测序结果。由于每种dNTP在反应 中产生的荧光颜色不同，因此可 以根据荧光的颜色来确定被测分 子的序列。反应结束后，游离的 dNTP会在双磷酸酶的作用下降解 ATP，导致荧
15、光淬灭，从而使反应 体系再生。作为一个反应器，由 于PTP板上每个小孔之间相互独 立，因而大大降低了反应的干扰 和误差。 22 TECHNOLOGYe-Science 技术 e-Science 2009年 在2008年，Roche公司推出了 454技术最新的GS FLX Titanium 系列试剂和软件，提升了读取长 度与测序通量，使454技术的平 均读取长度达到400 bp，每个循 环能产生总量为400-600 Mb的序 列，耗时约10小时5。454技术的 主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待 测序列中出现Poly(A)的情况下， 测序反应中会一次加上多个
16、T，而 加入T的数目只能从荧光信号的强 度来推测，有可能造成结果不准 确。也正是因为这个原因，454技 术主要的错误不是来自核苷酸的 替换，而是来自插入或缺失。454 技术最大的优势在于较长的读取 长度，使得后继的序列拼接工作 更加高效、准确。 2）Illumina公司的Solexa技术 Illumina公司的Genome Analyzer于2006年问世，它是 一种基于Solexa技术的测序系 统。该技术利用边合成边测序的 方法（sequence by synthesis, SBS），它的原理是6, 7, 25 （图 28）： 待测DNA文库的构建 把待测序列打断成200-500 bp的小片段，并在小片段两端加 上不同的接头，连接载体，构建 ssDNA文库。 D N A 与 流 动 槽 （ f l o w cell）的附着将这些ssDNA随机地 附着在流动槽表面的channel上。 流动槽是一种含有8个channel的 微纤维
