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1、双歧杆菌介导 HSV-tk/GCV 治疗大鼠膀胱癌的实验研究 殷祥瑞,唐伟,喻备,王亚荣(400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院泌尿外科)摘要：目的 观察双歧杆菌介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)治疗系统治疗大鼠膀胱癌的疗效及初步探讨其可能的作用机制。方法 N-甲基亚硝基脲(MNU）膀胱灌注法诱导大鼠膀胱肿瘤成功后随机分为 3 组，经尾静脉分别给予生理盐水（A 组） 、双歧杆菌/PGEX-5X-1 空质粒（B 组） 、双歧杆菌/PGEX-tk 重组质粒（C 组） ，联合腹腔灌注 GCV 治疗，治疗结束后对比各组膀胱重量，TUNEL 法检测各组凋亡情况，运用 R
2、T-PCR 和 Western blot 方法检测各组肿瘤组织细胞色素 C(Cyt-C)和 caspase-9 的 mRNA 和蛋白的表达。结果 C 组膀胱重量明显低于 A 组和 B 组（ P0.05)（图2）。0501001502002503003504001 2 3大鼠膀胱重量（mg）图1 HSV-tk基因PCR结果 图2 大鼠膀胱重量2.3 TUNEL法检测凋亡 TUNEL染色后在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞为凋亡细胞（图3），DAB显色后可见棕褐色颗粒为凋亡细胞（图4），两者均显示双歧杆菌重组质粒组凋亡细胞明显多于生理盐水组和双歧杆菌空质粒组。双歧杆菌重组质粒组凋亡细胞AI 值（71.
3、0610.13）%明显多于生理盐水组（15.785.86）%和双歧杆菌空质粒组(17.065.89)%（ P0.05）。2.4 RT-PCR法检测Cyt-C和caspase-9基因mRNA表达水平（表1）2.4.1 Cyt-C mRNA的表达 双歧杆菌重组质粒组Cyt-C mRNA表达水平（图5）明显高于与生理盐水组（ P0.05)。2.4.2 caspase-9 mRNA的表达双歧杆菌重组质粒组caspase-9 mRNA表达水平（图5）明显高于与生理盐水组（ P0.05)。图5 各组Cyt-C mRNA表达水平( )、caspase-9 mRNA表达水平( ) A B2.5 Western
4、 blot法检测Cyt-C和caspase-9基因蛋白表达水平(表1)1 2 3 41: DL1,000 DNA Marker 2:生理盐水组 3：双歧杆菌空质粒组 4：双歧杆菌重组质粒组1 2 3 4a b c图 3 TUNEL 染色后荧光显微镜（400）下观察各组膀胱肿瘤细胞a 生理盐水组 b 双歧杆菌空质粒组 c 双歧杆菌重组质粒组图 4 TUNEL 法 DAB 显色（400）观察各组膀胱肿瘤细胞a 生理盐水组 b 双歧杆菌空质粒组 c 双歧杆菌重组质粒组a b c2.5.1 Cyt-C蛋白的表达双歧杆菌重组质粒组Cyt-C基因蛋白表达水平（图6）明显高于与生理盐水组（ P0.05)。2
5、.5.2 caspase-9蛋白的表达双歧杆菌重组质粒组caspase-9基因蛋白表达水平（图6）明显高于与生理盐水组（ P0.05)。图6 Cyt-C和caspase-9在各组蛋白表达水平 表 1 Cyt-C 和 caspase-9 在各组的 mRNA 和蛋白表达水平（n=18, sx）组别 Cyt-C mRNA caspase-9 mRNA Cyt-C 蛋白 caspase-9 蛋白生理盐水组双歧杆菌空质粒组双歧杆菌重组质粒组0.230.080.270.060.780.090.150.060.190.060.590.110080040110030.730.150.040.020.060.0
6、20.480.083 讨论基因治疗指外源性基因导入人体以纠正内在基因缺陷的方法。基因治疗目前最缺乏的是具有肿瘤特异性的基因转移载体系统 3,4。双歧杆菌是人体中重要的益生菌，早已用于食品工业领域，美国食品与药物管理局（FDA）将其设为最高安全级别A级。Yazawa K等将双歧杆菌经静脉注射至Lewis肺癌小鼠体内，未见任何不良反应，血液中即使存在双歧杆菌，少量的氨苄青霉素即可将其杀死 4。Vaupel 等研究肿瘤组织中的氧分压，发现恶性实体瘤中心区域氧分压低至2.5mmHg以下，远低于正常组的24-66mmHg 5。双歧杆菌具有趋低氧环境的特性，经静脉途径给予后靶向定植于实体瘤,并在肿瘤局部增
7、生繁殖 6。双歧杆菌本身也有一定的促进肿瘤细胞凋亡的作用，这可能与它的免疫调节作用如激发局部炎症反应、招募免疫细胞等有关 7。双歧杆菌作为基因治疗靶向载体已A:生理盐水组 B:双歧杆菌空质粒组C:双歧杆菌重组质粒组经在肺癌、黑色素瘤、肝癌等动物实验中得到应用 811。本实验选用严格厌氧的婴儿双歧杆菌作为膀胱癌基因治疗的靶向载体，注射双歧杆菌后观察，未发现大鼠出现任何不良反应，在治疗结束处死大鼠后取瘤体组织镜检发现双歧杆菌。证明双歧杆菌具有安全性、靶向性，可以作为实体肿瘤基因治疗的靶向载体。自杀基因疗法是目前诸多基因治疗方法中最具临床应用潜力的方法之一12,13，其中HSV-tk/GCV系统是研
8、究得最早、最成熟、应用最广泛的自杀基因疗法。目前研究表明它主要通过两种机制诱导肿瘤细胞凋亡。一是自杀效应，HSV-tk基因表达产物胸苷激酶将无毒的GCV转变成具有羟基的三磷酸盐(GCV-TP)，它能插入DNA链中，引起碱基错配、DNA断裂、姐妹染色单体交换和致死性基因失稳定 14,15；GCV-TP还能抑制DNA聚合酶，进一步阻止DNA 合成 16，导致肿瘤细胞凋亡。二是“旁观者效应” ，但机制尚不明确，主要倾向于缝隙连接、毒性代谢产物释放, 细胞凋亡和机体免疫反应等方面。研究最多的是缝隙连接理论，GCV在HSV-tk +肿瘤细胞中磷酸化形成 GCV-TP后通过细胞的缝隙连接传递给临近的HSV
9、-tk -肿瘤细胞，诱导其凋亡 17,18。本实验中，我们将HSV-tk电转入婴儿双歧杆菌经大鼠尾静脉注射到荷瘤大鼠体内，联合腹腔灌注GCV,治疗后发现肿瘤体积明显缩小，膀胱重量减轻,说明该系统对大鼠膀胱癌有明显的抑瘤效果。TUNEL染色发现双歧杆菌重组质粒组凋亡细胞明显多于生理盐水组和双歧杆菌空质粒组，可能是HSV-tk/GCV系统的自杀效应和 “旁观者效应”导致肿瘤细胞凋亡。目前研究 1921认为肿瘤细胞的凋亡主要通过两种途径，一是外源性凋亡途径，死亡受体与其相应配体结合激活caspase-8 ，活化的caspase-8 通过caspase级联反应激活下游caspase-3 导致肿瘤细胞凋
10、亡。二是内源性凋亡途径，细胞内外的死亡信号传递到线粒体，线粒体释放Cyt-C至胞浆与Apaf-1 和pro-caspase-9形成凋亡复合体，凋亡复合体二聚化激活caspase-9 ，从而激活下游的caspase-3 发挥作用。本实验TUNEL染色检测凋亡，发现双歧杆菌重组质粒组凋亡指数明显高于其它两组,提示该治疗系统可能通过细胞凋亡途径导致肿瘤细胞凋亡。RT-PCR和western blot结果显示双歧杆菌重组质粒组Cyt-C和caspase-9基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于另外两组，差异显著，结合我们前期实验发现caspase-3蛋白高表达 1，我们推测双歧杆菌介导的HSV-tk/G
11、CV 治疗系统治疗大鼠膀胱癌通过上调Cyt-C和caspase-9的表达导致caspase 级联反应，使下游caspase-3 高表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡的内源性凋亡途径是导致膀胱肿瘤细胞凋亡的可能途径之一。总之，本实验发现双歧杆菌介导的HSV-tk/GCV治疗系统对大鼠膀胱癌有明显的抑瘤作用。它可能是通过细胞色素C为中心的内源性凋亡途径导致膀胱肿瘤细胞凋亡。我们下一步将通过差异蛋白组学等方法进一步揭示该治疗系统治疗膀胱癌的分子机制。希望通过对该治疗系统的深入研究与完善为膀胱癌的治疗带来新的途径。参考文献：1 Tang W, He Y, Zhou S, et al. A novel Bifi
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