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1、猪瘟疫苗的概述及制作过程,08动医班 401宿舍,猪瘟疫苗生产历程,19561957 猪瘟脾淋组织苗（湿苗） 19581959 猪瘟脾淋组织苗（湿苗） 19591963 猪瘟脾淋组织冻干苗 19641971 猪瘟乳兔组织苗（湿苗） 猪瘟牛体反应苗（湿苗） 19721973 猪瘟乳兔组织苗（湿苗） 猪瘟牛体反应苗（湿苗）,19741975 猪瘟乳兔组织冻干苗 19761981 猪瘟乳猪肾细胞冻干苗 19811983 猪瘟乳兔组织冻干苗 19821987 猪瘟羊肾细胞冻干苗 19872002 猪瘟牛睾丸细胞冻干苗 2002至今 猪瘟牛睾丸细胞冻干苗 猪瘟脾淋组织冻干苗,猪瘟疫苗系列 1.猪瘟细胞苗
2、 （1）普通苗 （2）零免苗 （3）精制苗 （4）政府采购专用苗 2.猪瘟脾淋苗 （1）普通苗 （2）政府采购专用苗,我国猪瘟的流行特点,流行范围广 呈散发流行趋势 发病年龄小，成年猪带毒现象严重 非典型和繁殖障碍型猪瘟增多 免疫失败现象严重 与猪蓝耳病、猪园环病毒病、猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪肺疫等并发或继发感染,我国猪瘟疫苗的特点,我国的猪瘟疫苗是用中国系猪瘟兔化弱毒株（简称C株）生产的，它是我国于20世纪50年代初期，从河北省石家庄地区的患猪瘟的病猪中分离到的一株猪瘟强毒，称为石门株（Shimen strain），将该强毒株通过大耳白兔经历4年多时间，传代至430代，使毒力减弱成为疫苗株
3、，即C株。,C株的特点： 免疫原性良好，经肌肉注射可产生坚强的免疫力，并可维持12年。 免疫力产生快，48小时产生完全免疫力，96小时产生坚强免疫力。 安全性高，反应小，各种类型的猪均可使用 ，剂量加大至1020头份甚至更大无明显不良反应。 稳定性好，不变异，不散毒，不返祖。C株疫苗早已是被世界公认的优秀疫苗，并在国内及其它国家广泛应用获得很高的评价。,猪瘟免疫失败的原因,疫苗质量不高 疫苗管理不当 免疫程序不合理 猪群中存在其它免疫抑制病感染 母猪持续感染和仔猪胎盘感染是免疫失败的重要原因 猪瘟亚临床感染胎盘感染母猪繁殖障碍仔猪带毒 后备母猪 亚临床感染 免疫后过敏反应时有发生,猪瘟疫苗的制
4、作过程,一、细胞培养 1、制苗用细胞 牛睾丸细胞或羊肾细胞。 2、生长培养液 目前的细胞培养液为乳汉（欧）液，或MEM10%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.07.2左右。 3、维持液 目前的维持液为乳汉（欧）液，或MEM25%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.47.6。,细胞生长良好的几个注意事项,（1）制苗用细胞应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的14日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。其家H健康生长的 （2）培养基和血清的质量可靠、稳定。应确保无外源病毒、支原体、细菌等污染，无牛病毒性腹泻病毒（BVDV）及其抗体。用于生产猪瘟细胞苗的牛血清都要事先检测
5、有无BVDV中和抗体的存在。 （3）制备原代牛睾丸细胞时，防止细胞消化过度。 （4）合适、营养丰富的细胞培养基。丰富的营养成分对细胞的生长、带毒状态维持和毒价的提高有直接影响。 （5）转瓶的洗涤应遵循严格的清洗程序。转瓶洗涤不干净，容易导致细胞不贴壁生长。,二、 病毒感染、维持和收获 1.生产用毒种有脾毒和细胞毒，脾毒是用选择定型热反应兔脾脏冷冻或冻干保存制备的；细胞毒是将用新鲜脾毒制成0.3%0.5%的病毒悬液接种生长良好的牛睾丸细胞或羊肾单层细胞，取二收、三收的细胞培养液作为生产用毒种。脾毒应选择兔体反应在36小时之前，同时防止脾毒采集过程的污染。,该病毒不产生细胞病变效应(CPE)，可连
6、续多次收液。取已形成良好单层的牛睾丸细胞（或羊肾细胞），弃去培养液，接种含3%5%细胞毒种或0.2%0.3%脾毒种的维持液。接毒后4或5日第一次收获换液，以后每46日收获换液1次，可连续1215收左右，有的厂家可收更多。一般来说，1215收前的毒价合格率高，疫苗质量好。接毒时，细胞生长状态的好坏影响细胞产毒。也可对细胞带毒分散，分散比率1：4左右，可增加收次和产量。 将检验合格的病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按一定比例混合，分装，进行冻干。,猪瘟病毒的病毒特征,1、猪瘟病毒（HCV）感染细胞超薄切片的电子显微镜观察表明，该病毒颗粒在膜结合的胞浆内空胞中装配并成熟，然后经胞外释放。 2、56
7、处理60分钟或6010分钟可灭活细胞培养液中的HCV。HCV在pH510时稳定，pH5.2时最适宜生长，但在低于pH4或高于pH11时快速灭活。 3、猪瘟病毒的抗原性和血清学与牛粘膜/病毒性腹泻病毒(MD/BVDV)密切相关，两者同源性很高，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体，细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其抗体，可与猪瘟病毒发生中和反应，造成疫苗生产的失败。,病毒收获液毒价不高的可能原因,如果病毒收获液毒价不高，即病毒家兔感染量（RID）较低，制成的疫苗易造成免疫失败。猪瘟疫苗生产中毒价不高的可能原因： 1）细胞培养液（乳汉液）营养不足，尤其是使用高压灭菌液，高温可使一些营
8、养成分损失，造成细胞生长状态不良； 2）细胞培养液较多存在外源病毒，尤其是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）会直接造成病毒滴度降低； 3）成熟释放的病毒在维持液中耐受性较差，造成病毒滴度较低； 4）病毒毒种毒力较低，并在传代过程中弱化。,猪瘟疫苗生产工艺改进的几点考虑,1、使用化学成分明确的细胞培养基 化学成分明确的细胞培养基一方面能提供足够的营养，供细胞生长，同时避免动物来源成分（如由水解乳蛋白）带来外源病毒（如BVDV）及其抗体的污染。 2、使用低血清细胞培养基，减少血清使用量，提高细胞维持时间 清大天一有适合细胞培养生长的低血清MEM（MD611）细胞培养基，可使血清使用量减少50左右，减少了
9、外源因子污染的几率；并且由于该细胞培养基营养成分较传统细胞培养基丰富，可提高细胞活力水平，增加细胞维持时的营养供给。 3、使用改良的转瓶培养细胞 使用多层转瓶培养细胞可使单位体积溶液内的细胞数量增加，一方面提高了细胞密度，病毒增殖数量较大；另一方面也对病毒液进行了浓缩，提高了病毒原液的病毒量。 4、尽量减少水解乳蛋白的批间差，防止疫苗生产过程的不稳定情况。 5、使用质量保证的牛血清 血清是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的主要来源，使用质量可靠、无外源病毒的血清可减少此类污染。 6、筛选、克隆较高毒力的毒种 使用营养成分丰富的细胞培养基筛选较高毒力的毒种，并用之做克隆毒种，制备具较高毒力的毒种。
10、7、使用病毒保护剂有资料显示，在细胞维持液中加入病毒耐热保护剂可减少无效病毒粒子的产生，提高病毒滴度。,猪瘟精制苗,设计原理,猪瘟野毒持续性感染普遍存在，免疫水平偏低或不均，导致非典型、慢性猪瘟和隐性感染 采用大剂量的高度免疫，压制猪瘟强毒的繁殖 猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病等免疫抑制病的存在，影响猪瘟疫苗免疫效果 加大免疫剂量，提高免疫效果 仔猪母源抗体较高且可维持至35日龄以上，如在20日龄进行猪瘟活疫苗首免时，母源抗体可不同程度干扰猪瘟弱毒株在仔猪体内复制，从而影响免疫效果 加大免疫剂量，部分疫苗毒被母源抗体中和后仍能达到理想的免疫效果 种猪高强度的反复免疫，抗体水平较高，对猪瘟疫
11、苗产生中和作用影响免疫效果 加大免疫剂量，部分疫苗毒被抗体中和后仍能达到理想的免疫效果,欧洲药典规定用C株疫苗免疫时，每头肌注剂量为100PD50 我国原规程约37PD50 台湾猪瘟细胞苗配苗细胞毒液以160000RID/ml为合格 我国原规程50000RID/ml “精制苗”内控标准12000RID/头份 我国原规程750RID/头份,精制苗特点,配苗用2-4收细胞毒液 500000RID/ml 我国原规程50000RID/ml 疫苗病毒含量高，每头份病毒含量12000RID 采用大剂量高度免疫，压制猪瘟强毒的繁殖，减少亚临床感染和慢性猪瘟的发生，适合猪瘟阳性场猪瘟净化 使用对象主要是种猪，
12、种猪经反复免疫抗体水平很高，考虑到疫苗毒被部分中和后仍能起到理想的免疫效果 采用进口原材料和浓缩纯化工艺，每头份疫苗异源蛋白含量少，大大降低因血清引起的过敏反应,用法与用量,按要求头份稀释，每头猪肌肉注射1头份,猪瘟零免苗,设计原理,猪瘟出现持续感染，除垂直传播外，更多的是通过带毒母猪长期散毒，感染初生仔猪 先于野毒快速占领免疫靶位，加速抗原递呈 仔猪母源抗体一般可维持至35日龄以上，在20日龄进行猪瘟活疫苗首免时，母源抗体可不同程度干扰猪瘟弱毒株在仔猪体内复制，从而影响免疫效果 避开母源抗体干扰,超前免疫,亦称乳前免疫或零时免疫 在初生仔猪吮吸初乳前接种疫苗，使其免受母源抗体干扰，并在可能感
13、染猪瘟强毒前让疫苗株病毒快速占领免疫靶位，诱导免疫反应，使初生仔猪获得免疫保护的一种免疫接种方法。 一般初生仔猪免疫后1-2小时哺乳 ，所以考虑部分疫苗毒被母 源抗体中和后仍能达到理想的免疫效果，必须加大免疫剂量,1979：法国Coitheiev等首先提出超前免疫原理 1979：台湾赖秀穗进行猪瘟超前免疫田间试验 20世纪80年代初：我国有不少关于初生仔猪猪瘟超前免疫的报道 1999：中国兽医药品监察所猪瘟参考实验室丘惠深研究员的指导下，开发出专用于猪瘟超前免疫的“零免”猪瘟细胞苗，并注册了“零免”商标，在全国推广使用1.8亿多头份，应用效果确实,猪瘟零免苗的特点,先于病毒前快速占领免疫靶位，
14、加速抗原递呈，避开母源抗体干扰，产生较好的免疫力 配苗用2-4收细胞毒液 300000RID/ml 我国原规程50000RID/ml 疫苗病毒含量高，每头份病毒含量6000RID 采用进口原材料、低血清培养和浓缩纯化工艺，每头份疫苗异源蛋白含量少，大大降低因血清引起的过敏反应,用法与用量,按要求头份稀释，初生仔猪哺乳前每头肌注1头份，免疫后1小时才可哺乳 (仔猪零时免疫专用：常规免疫效果更佳),猪瘟脾淋疫苗,抗原性好为普通细胞苗的5倍 抗原含量高与国际标准接轨 低过敏（组织成份单纯）过敏源含量极低 非特异性免疫增强数十种淋巴细胞免疫因子协同作用 无牛病毒性腹泻病毒污染风险，接种猪群安全 免疫猪
15、群抗体水平高，抗体滴度均匀 缺点：生产成本高 使用： 猪瘟的加强免疫、猪瘟的紧急免疫接种 控制慢性猪瘟、非典型猪瘟、温和型猪瘟有特效,我国各种猪瘟疫苗的比较,母猪： 断奶时注射猪瘟脾淋疫苗12头份 或集中统一免疫，一年注射3次，每次注射猪瘟脾淋疫苗12头份，集中统一免疫时，注意配种后15天内、产前15天内的母猪不注射，15天后加以补注 公猪： 一年免疫二次，每次注射猪瘟脾淋疫苗12头份 后备种猪： 使用前注射猪瘟脾淋疫苗12头份。,规模化猪场猪瘟免疫,仔猪：A. 猪瘟非严重污染地区（场） 2030日龄（根据仔猪母源抗体监测结果确定）注射普通猪瘟细胞疫苗4头份（或零免猪瘟活疫苗2头份，精制猪瘟苗
16、1头份/头，效果更佳，应激反应更小） 60 70日龄时同剂量再加强免疫一次，如选为种用仔猪，建议用猪瘟脾淋疫苗12头份。,规模化猪场猪瘟免疫,仔猪：B.猪瘟污染较重地区,或疑有母猪猪瘟带毒猪场 采用0-35-70免疫模式，即： 0时免疫，仔猪吃初乳前1小注射零免猪瘟活疫苗1头份/头； 35日龄注射零免猪瘟活疫苗2头份，或精制猪瘟苗1头份/头，或猪瘟脾淋疫苗12头份 70日龄注射猪瘟脾淋疫苗12头份,规模化猪场猪瘟免疫,猪瘟细胞苗和猪瘟组织苗的正确使用,猪瘟细胞苗便于工厂化大量生产，且成本较低。在每次免疫剂量不低于750RID的情况下，已可达到既能防止临床发病，又能保护不发生亚临床感染，所谓达到了“双保护”的水平，所以使用猪瘟细胞苗免疫在一般情况下即可以满足需要。但是，细胞苗降解速度较快，如经稀释后在15时6小时失效，在2027时约3小时失效。猪瘟组织苗毒价高，而
