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1、实 验 四,培养基的制备、器具包扎和灭菌,目 的 要 求,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实验原理,培养基 据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 剧用途可分为 1.基础培养基：能满足各种微生物的营养需求 .加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其快速生长，便于分离 3.选择培养基：加入某种物质抑制其他
2、微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离 4.鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。,从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的方法。 灭菌：采用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物的方法。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物
3、品放入其中。 2.接通电源，进行加热 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养
4、过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。,实
5、验材料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、紫外线杀菌灯。 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。,实验步骤,培养基的配制 分离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌,培养基的配制方法和步骤,1 称量 按培养基配方（见附录）比例依次准确地称取试剂、药品等 放入烧 杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放
6、在小烧杯或表面皿中称量，用热水 溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时 如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白 胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。称药品时严防药品混杂，一把 牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另 一药品，瓶盖也不要盖错。 2 溶化 在装有试剂和药品的烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀 ，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到 所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药 品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊 底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。,3 调
7、pH 在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始 pH 值，如果 pH 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/L NaOH ，边加边搅 拌，并随时用 pH 试纸测其 pH 值，直至达到所需 pH 值。反之， 则用 1mol/L HCL 进行调节。注意 pH 值不要调过头，以避免回调， 否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 4 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求 的情况下，这一步可以省去。 5 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装 过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起 污染。 （ 1 ）液体分装 分装高
8、度以试管高度的 1/4 左右为宜。 （ 2 ）固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5 ，灭菌后制成 斜面，分装三角瓶的量不超过三角烧瓶容积的一半为宜。,6 加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以防止外 界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以 防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注 明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻 绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名 称、组别、日期。 8 灭菌 一般培养基是在 1.0 5 / 2
9、 （ 15 磅 / 英寸 2 ）， 121.3 ， 15-30 分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入 冰箱内暂存。,9 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50 左右，将试管棉塞端搁在玻棒上， 搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 10 无菌检查 将灭菌的培养基放入 37 的温室中培养 24 48 小时，以检查灭菌是否彻底。,培养基的配制方法和步骤,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.07.2 灭菌 1.05kg/cm2， 2530min,马铃薯蔗
10、糖琼脂培养基,用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基，其配方如下： 去皮马铃薯（或鲜豆芽） 200g 蔗糖 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm2 20min,高氏一号培养基,用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g pH 7.47.6 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 1.05kg/cm2 30min,制备无菌水,无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。 250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。,三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。,现场演示,物品的准备,思考题,固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 培养基中加琼脂的作用是什么？ 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？,实 验 四,结 束,
