土壤微生物基因表达研究

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1、土壤微生物的基因表达,了解微生物的功能 了解微生物与环境的关系 有益微生物 有用的基因 环境指标,1.为什么要对土壤微生物进行研究,对微生物种类定性 对微生物功能定性 对特定的基因定性和定量研究 微生物或微生物基因的表达如何受环境调控？,2.研究内容,收集 培养 筛选 鉴定 克隆特定基因（同源序列，表达文库，消减杂交等方法）,3.1.研究微生物基因表达的一般方法,99%的土壤微生物是不可培养的 培养中的土壤微生物功能不完善 某些在极端环境生活的微生物 原位研究方法,PROBLEM & STRATEGY,以提取土壤DNA和RNA为基础，结合一系列研究方法 优点： 无需培养，直接反映环境中微生物的

2、状态； 所研究是微生物同环境直接的关系 缺点： 从土壤样品提取DNA和RNA的效率,3.2.原位研究土壤微生物基因表达的方法,从土壤样品提取核酸困难的原因,不同处理方法的效果,DNA芯片 实时定量-PCR 稳定同位素探针 报告基因,3.3.新技术和新方法,基因芯片是将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上，形成矩阵。将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。,3.3.1.DNA芯片技术,1992年，Affymatrix公

3、司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。 1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期,历史,高通量 微型化 自动化 低成本 高度并行,DNA芯片的特点,技术流程示意图,实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光

4、化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。,3.3.2Real-time PCR,Ct值,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,Real-time PCR原理,荧光染料嵌合法,探针法,3.3.3.稳定同位素探针,稳定同位素探针,氯化铯密度梯度离心,实验流程,可以检测不同环境下基因的表达 通过融合表达，可以对特定基因进行定量分析 绿色荧光蛋白（GFP）,

5、发现于水母（Aequorea victoria）和海肾（Renilla reniformis） GFP在原核和真核生物中都能表达，不需要底物和协同因子，很容易被检测，即使单个细胞，具有很好的稳定性,3.3.4.报告基因,GFP,3.3.5.环境基因组文库,环境基因组文库的功能,16S rRNA鉴定微生物,功能基因的克隆,4.研究环境微生物的内容及方法,各种方法和技术,培养方法：形态、生理生化指标等，16S rRNA技术 原位方法： 16S rRNA结合DNA芯片技术,4.1.环境微生物种类的鉴定,环境微生物的鉴定形态、理化指标,16S rRNA是原核生物的一种核糖体RNA 其在生物进化过程中，

6、序列变化非常缓慢，可用来标记生物进化距离和亲缘关系。 分析的一般方法是从微生物样本中提取16S rRNA基因片段，通过测序获得序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定微生物种类 目前，GEN-BANK已经涵盖了不下10万种原核生物的16S rRNA基因序列信息,16S rRNA分析技术,稳定同位素探针结合FISH鉴定微生物种类,培养方法：抗逆，特殊氮源、碳源的利用，毒性等 原位方法：特定基因的表达研究,4.2.环境微生物功能的鉴定,原位研究环境微生物的固氮基因,功能基因的定性：基因芯片，同源序列克隆，环境基因组计划，差异显示技术，分子信标 功能基因

7、的定量：Northern，原位杂交，RNase保护实验，RT-PCR,4.3.对土壤微生物基因表达的研究,mRNA差异显示技术,分子信标,竞争性RT-PCR,营养状况 同污染物的分解相关的基因 含氧状态 土壤pH 土壤温度和湿度,4.4.影响基因表达的环境因素,碳源 氮源 磷源 微生物的固氮作用 相关基因的表达及调控,4.4.1营养状况,碳源对微生物固氮作用的影响,大量的微生物可以利用土壤环境中非自然的污染物。研究土壤环境中的生物回收技术是可行的，但是，成功的回收有赖于稳定而强大的微生物活力。大量的环境因子会影响与生物回收相关的微生物的活力。一些研究者已经开始应用功能基因作用于环境污染物的降解

8、。 Holden等鉴定了受十六烷污染的沙中表达的表面活性组分基因。将gfp融合在pra和rhlR的启动子后边，其中pra编码的PA蛋白起乳化作用。使用灭菌的石英砂作为培养基质。当16烷是唯一碳源时，细菌最初的C:N是12。gfp表达表明pra和rhlR都被诱导了。然而，即使这些编码表面活性组分的基因转录被激活了，细菌降解十六烷的能力仍未提高。,4.4.2微生物对污染物的降解,环境对基因表达的影响,启动子陷阱,氧是土壤中另一环境因子，土壤微生物必需适应环境中氧浓度的不断变化。 在缺氧条件下，一些特定的蛋白获得了大量的表达。 然而，对于土壤环境中氧对基因表达的调节还缺乏直接的数据。,4.4.3氧对

9、微生物基因表达的影响,用lux同参与萘降解途径的基因融合 在对土壤的生物发光量直接探测时，使用了一种便携式照片扩增管，使用时只需将小管插插入不同深度的土壤中就可以定量了 研究表明氧是萘降解的一个限制因子，也是影响萘降解途径表达的关键因子。,氧对基因表达的影响,Baumann等用点杂交检测了硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化氮还原酶的mRNA的转录水平。发现氧会限制这些基因的表达，同时也会抑制Paracoccus denitrificans的去硝化过程。 细菌在有氧和无氧条件下都能生长，在无氧条件下酶的最大表达量同N2O的最大合成率相一致，而N2O是去硝化过程的气体产物。在缺氧条件下去硝化过程加强而在有氧

10、条件下去硝化过程减弱。,氧对基因表达的影响,土壤pH对土壤微生物的生理、形态和代谢有重大影响 土壤微生物生存环境中的含水量变化范围很大，水对细胞的所有生理功能都很重要，因此，湿度会影响土壤微生物的基因表达 温度在土壤微生物的很多化学反应和生物相互作用中起着重要作用。土壤中，温度变化最快的部分为表面部分。因此，对这部分土壤中微生物来说温度对它们的基因表达有着深远的影响。,4.4.4pH、湿度和温度,对土壤微生物的研究依赖于新技术和新方法的应用 新技术和新方法的应用使研究水平大为提高，但是，现有方法均在某方面存在缺陷 比如：DNA芯片忽略了基因的多样性，Real-time PCR对引物或探针的特异性要求很高，稳定同位素技术需要很长的实验周期，报告基因表达不受控制等 原位研究的核心难题还是核酸的提取 对一些因素还没有很好的研究方法，比如基因表达的时效性,研究展望,谢谢各位！,